来自软珊瑚Sclerophytum humesi的具有前所未有的oxatricyclo[7.2.1.01,9]dodecane骨架的对映体诺倍半萜类化合物，能够实现对乙酰胆碱酯酶（AChE）、丁酰胆碱酯酶（BChE）和β-淀粉样前体蛋白酶（BACE1）的立体选择性抑制

《Bioorganic Chemistry》：Stereoselective AChE/BChE/BACE1 inhibition by enantiomeric norsesquiterpenoids with an unprecedented oxatricyclo[7.2.1.01,9]dodecane scaffold from the soft coral Sclerophytum humesi

酮还原酶（KREDs）作为工业生物催化核心酶，在高效手性合成中展现高选择性与温和反应条件优势，广泛应用于制药、精细化学品及农业领域。本文系统综述KREDs的进化分类、底物特异性、酶工程策略及产业化挑战，指出定向进化与高通量筛选显著提升酶性能，但需解决酶循环与规模化生产难题，未来将推动可持续绿色化学发展。

　　

作者：Shivam Pawar、Saujanya Mahajan、Pooja Sahu、Priyanka Bajaj

印度海得拉巴国家制药教育与研究学院（NIPER）

摘要

随着对可持续且成本效益高的制造方法的日益需求，酮还原酶（KREDs）在工业生物催化领域处于前沿地位。作为不对称合成中最广泛应用的氧化还原酶类别之一，KREDs在温和的反应条件下表现出高对映选择性和操作简便性。这些酶能够催化酮类化合物不对称还原为手性醇分子，这些分子在制药、精细化工、农用化学品和香料工业中起着核心作用，同时将对环境的影响降至最低。本文全面概述了KREDs的发现、自然多样性、进化分类、底物选择性以及结构多样性分析。我们讨论了底物范围、立体化学偏好以及它们对短链和长链羰基化合物的适应性。文章还探讨了酶工程方面的最新进展，包括定向进化、理性设计和高通量筛选技术，这些技术有助于提高催化效率、稳定性和底物耐受性，从而实现大规模应用。此外，文章分析了KREDs在工业上的重要性，并参考了全球活性药物成分（API）市场趋势以及生物催化剂市场中KREDs的应用和增长趋势。尽管取得了显著成就，但辅因子回收和工艺可扩展性等限制仍然阻碍了其广泛应用。本文最后提出了将KREDs整合到可持续生物制造和绿色化学中的前瞻性观点。

引言

在过去二十年里，工业生物催化领域经历了革命性的发展，酶因其高选择性、可持续性和温和的操作条件而逐渐取代了传统的化学催化剂[1]。其中，酮还原酶（KREDs）在不对称还原前手性酮类化合物为手性醇类化合物方面受到了特别关注[2]。KREDs的实用性源于其内在的高化学选择性和对映选择性，这得益于活性位点的不对称性和辅因子控制的氢化物传递，使得在温和条件下能够实现手性醇类的立体选择性合成。这些特性在活性药物成分（APIs）、精细化学品和药物中间体的生产中尤为重要，因为中间体的立体化学纯度会显著影响最终产品的疗效和安全性。KREDs主要属于短链脱氢酶/还原酶（SDR）超家族，少数属于醛酮还原酶（AKR）家族，它们催化NAD(P)H依赖性的酮类化合物不对称还原为光学活性的仲醇[3][4]。研究人员和工业界对KREDs的兴趣呈指数级增长，这不仅是因为它们的立体特异性，还因为通过蛋白质工程实现的底物灵活性和适应性，使它们成为复杂合成路线中的宝贵生物催化剂[5]。根据最新的市场报告，全球生物催化市场预计从2023年的84亿美元增长到2030年的140亿美元以上，其中KREDs酶占据了重要份额，因为它们在手性醇类生产中起着关键作用。KREDs在制药工业中的价值体现在它们能够对高价值API（如他汀类药物[6]、抗抑郁药[7]、抗癌药物[8]和抗病毒药物[9]）进行对映选择性合成。使用KREDs的生物催化显著提高了工艺经济性，无需保护基团化学修饰或拆分步骤。KREDs在生物催化合成中的首次工业应用可以追溯到20世纪90年代末，当时它被用于降低胆固醇的他汀类药物合成中的β-酮酯中间体的立体选择性还原[6]。这一成就标志着制药行业从使用手性辅助剂和拆分技术向酶催化不对称合成的转变[10]。此后，随着高通量筛选、酶固定化和辅因子再生策略的发展，KREDs在多步骤合成途径中的整合速度加快。Codexis、Novonesis（前身为Novozymes）和BASF等公司已经商业化了一系列为工业用途设计的工程化KREDs，体现了向酶催化合成转型的趋势。表1展示了KREDs在多种治疗类别的活性药物成分和关键药物中间体合成中的代表性工业应用（见图1）。

除了制药应用外，KREDs在精细化学品、农用化学品以及香料和香精中间体的合成中也得到了越来越多的应用[2]。它们广泛的底物谱和可调的立体化学控制能力使其成为可持续化学制造的首选。宏基因组学和生物信息学的持续进步大大扩展了已知的KREDs自然多样性，从微生物、真菌和极端微生物来源发现了具有独特催化特性的新酶。此外，包括结构导向的酶工程、机器学习和分子动力学模拟在内的计算工具越来越多地被用于预测底物兼容性和优化催化性能[5][11]。尽管酮还原酶反应取得了显著进展，但仍存在一些限制，阻碍了其广泛工业应用。目前，定向进化、结构导向的理性设计和酶固定化策略的创新正在逐步解决这些限制，为更稳健和经济的工业应用铺平了道路[12]。本文旨在全面概述KREDs的发现、进化、分类、底物范围、立体化学多样性及其催化机制。同时，文章还探讨了酶工程和高通量筛选方法的最新进展，这些进展扩展了它们的工业应用潜力。此外，文章还讨论了KREDs当前的全球市场状况，包括工业采用趋势、经济影响以及大规模实施所面临的挑战。最后，我们提出了将KREDs整合到可持续生物制造系统中的未来展望及其在塑造下一代绿色工业化学中的作用。

KRED及其催化机制

在KRED催化的还原反应中，吡啶核苷酸辅因子（NADH或NADPH）将氢化物转移到前手性羰基碳上。随后，活性位点残基（通常是Tyr或Ser）将羰基氧质子化，释放出手性醇。烟酰胺环相对于底物的位置、羰基碳上两个取代基的大小和形状以及底物在活性位点中的取向都会影响立体化学（即羰基的哪一面）

KRED的发现与进化

KREDs的发现和进化是酶学和生物催化领域的重要篇章。KREDs最初是从哺乳动物中的酒精脱氢酶（ADHs）研究发展而来的，最初因其能够催化羰基化合物的立体选择性还原而受到关注。几十年来，研究范围扩展到了微生物来源，发现了底物特异性、立体化学结果和催化效率方面的显著多样性。

分类与超家族组织

在微生物、植物和动物来源中发现的KREDs多样性不断增加，因此需要对其进行系统分类。了解这些酶的分类有助于理解它们的结构组织、催化行为和辅因子偏好。KREDs被归类为氧化还原酶（EC 1.1.1.x），它们催化NAD(P)H依赖性的羰基化合物还原反应，以NAD?或NADP?作为电子受体[94][95]。

底物范围与选择性

KREDs已成为学术和工业生物催化中的关键工具，特别是在手性构建块和药物中间体的生产中。由于广泛的底物范围和多样的选择性，许多羰基底物（如脂肪族、芳香族和杂环酮类）都可以被KREDs还原。KREDs的功能多样性是由于不同微生物物种之间的进化分歧造成的，这种分歧反映了代谢特化和环境因素的影响

KRED的工程与进化

当工程手段（定向进化、位点饱和突变和结构导向设计）明确针对关键机制热点时（如改变口袋体积的残基或与羰基氧相互作用的残基，以及控制通道通路的环状结构）会取得成功。例如，对L. kefir SDR的定向进化产生了具有更高热稳定性和反向立体选择性的变体，这是通过加强固定活性构象的氢键网络实现的；分子动力学（MD）等研究也对此有所贡献

高通量筛选

蛋白质工程和定向进化的快速发展产生了大量的KRED变体库，每个库包含数千个具有潜在独特催化特性的突变体。然而，从如此庞大的库中识别出优秀候选者需要高效的分析和筛选平台。传统的低通量测定方法往往无法胜任这一任务，因此需要采用高通量筛选（HTS）策略来评估酶的性能

酮还原酶的市场份额

工业酶领域已成为绿色和可持续制造的基石，生物催化剂越来越多地替代了传统金属或化学催化剂，应用于关键合成途径。尽管由于专利限制，公开数据集中并未明确报告KREDs的市场份额，但可以通过研究更广泛的酶和氧化还原酶市场趋势来合理估计其市场份额。在预测期内

未来展望

KREDs是最通用且应用最广泛的生物催化剂之一，用于手性醇的不对称合成，并已在多种重要药物中间体和活性药物成分（如(S)-Licarbazepine[14]、Duloxetine[15]、Atorvastatin[6]和Ipatasertib[13]等）的制造中发挥了重要作用。它们的高对映选择性和广泛的反应范围以及与可持续加工的兼容性使其在工业应用中极具吸引力

CRediT作者贡献声明

Shivam Pawar：撰写原始草稿、软件开发、资源提供。Saujanya Mahajan：撰写原始草稿、软件开发、资源提供。Pooja Sahu：审稿与编辑、数据分析、数据管理。Priyanka Bajaj：项目监督、概念规划。

伦理批准

本文不包含任何涉及人类参与者或动物的研究。

资助

本项工作得到了印度海得拉巴国家制药教育与研究学院（NIPER）的支持，资金来源包括科学技术部（DST）（项目编号：SRG/2022001467）和DST-Inspire奖学金（项目编号：IF210504）。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢海得拉巴国家制药教育与研究学院（NIPER）提供的必要研究设施、学术环境和机构支持，使这项工作得以完成。