《Bioresource Technology》：Metagenomic mining and functional reconstitution of hexanoic acid biosynthetic enzymes from Baijiu pit bottom
编辑推荐：
本研究通过分析江式白酒窖泥底部的微生物群落，鉴定出关键酶HBD和CAT，并在工程酵母中实现异源表达，显著提高己酸产量，为合成生物学提供新策略。
Xinjian Wang|Xuehui Huo|Huannuo Hu|Yumei Wang|Wenwen Cheng|Yupeng Wang|Chunhong Sun|Xiaole Wu|Yefu Chen
教育部工业发酵微生物学重点实验室，天津科技大学生物技术学院，天津300457，中国
摘要
己酸是白酒中的关键风味化合物，也是一种有价值的平台化学品，但其高效生物合成仍然具有挑战性。为了克服Saccharomyces cerevisiae中反向β-氧化（RBO）途径中的碳链延长瓶颈，本研究探索了来自江味白酒窖底产生己酸的微生物群落的宏基因组资源。获得了三种富集的己酸产生菌群，它们都能共同产生丁酸、己酸和辛酸。宏基因组分析表明，尽管微生物组成不同，但这些菌群具有相似的核心功能酶。进一步的相关性分析确定了3-羟基酰基-CoA脱氢酶（HBD）和乙酸CoA转移酶（CAT）是与己酸合成正相关的关键酶。随后将这些酶在工程化的RBO途径酵母菌株中表达。CAT-1的表达使丁酸和己酸的产量分别增加了25%和34%，这标志着CAT首次被用于增强酵母中的链延长。总之，本研究创新地从江味白酒窖底的微生物群中鉴定出了关键酶CAT，并通过异源表达实现了高效的己酸合成。这项工作不仅为挖掘高性能酶提供了策略，还为己酸的高效生物合成提供了理论支持和技术参考。
引言
在食品工业中，己酸是白酒中的重要风味成分，也是天然酯类（如己酸乙酯）的前体，后者赋予白酒特有的菠萝香气（Chen等人，2025年；Miao等人，2022年）。此外，由于其高能量密度，它比乙醇或乳酸等前体更具优势（Zhao等人，2024年）。目前，商业己酸主要通过不可持续的石化路线或植物油的化学加工生产，这两种方法都存在重金属污染和复杂副产物形成的缺点（Venkateswar Reddy等人，2020年）。虽然微生物发酵利用可再生碳源提供了一种可持续的绿色化学替代方案，但目前的工业产量仍不足以满足大规模生产的需求。
Saccharomyces cerevisiae由于其强大的适应性和对有机酸的高耐受性，是生产己酸等短链和中链脂肪酸的理想宿主（Fernandez-Moya & Da Silva，2017年）。这些脂肪酸通过脂肪酸合成酶（FAS）途径合成，以乙酰-CoA和丙二酰-CoA为主要底物。该过程包括乙酰-ACP和丙二酰-ACP的缩合，随后逐步还原为酰基-ACP，再通过硫酯酶水解为游离脂肪酸（Gajewski等人，2017年）。然而，天然的FAS途径在生成丁酰-CoA和己酰-CoA前体方面效率较低。通过包括FAS工程改造、转运蛋白筛选和实验室适应性进化在内的综合策略，S. cerevisiae中的己酸产量已达到300毫克/升（Zhu等人，2020年）。
反向β-氧化（RBO）为脂肪酸生物合成提供了一种热力学上更高效的替代途径。与受到严格反馈抑制和大量ATP消耗限制的FAS不同，RBO途径（本质上是降解过程的逆转）所需的能量较少，并且理论产量更高（Dellomonaco等人，2011年）。此外，异源RBO元件可以更容易地绕过S. cerevisiae复杂的代谢调控。在Clostridium等厌氧细菌中，RBO是丁酸和己酸合成的主要途径，从乙酰-CoA开始，最终通过CoA转移酶步骤释放游离脂肪酸并回收乙酰-CoA（Huang等人，2024年；Yuan等人，2022年）。RBO途径最初被引入S. cerevisiae用于1-丁醇的生产，最终产量为2.5毫克/升（Steen等人，2008年）。后续研究利用这一途径在酵母中增强了细胞质中酰基-CoA的可用性；结合硫酯酶和醇酰基转移酶，可以生产短链脂肪酸及其乙酯（Garces Daza等人，2023年；Lian和Zhao，2015年）。最近通过组合优化异源酶，在S. cerevisiae中提高了己酸（101.74毫克/升）和己酸乙酯（42.35毫克/升）的产量（Zhang等人，2022年）。然而，效率受到辅因子不匹配和缺乏具有中等链底物高亲和力的末端酶（特别是CoA转移酶和硫酯酶）的阻碍。因此，鉴定具有优异催化性能的新酶成分是增强中链脂肪酸合成的关键挑战。
在中国白酒发酵的背景下，复杂的微生物群落及其多样的酶对于生成酯类、酸类和醇类等关键风味化合物至关重要（Wu等人，2024年）。己酸是浓香型和江香型白酒中的关键风味成分，主要由栖息在窖泥中的微生物合成（Li等人，2025年）。这种环境通过反复发酵周期的逐步驯化，从新鲜的黄土演变为成熟的微生物生态系统（Zheng等人，2015年）。成熟的窖泥中栖息着多种具有高合成能力的己酸产生微生物（Ren等人，2024年）。虽然成熟的窖泥中含有多种高产己酸的微生物（如Clostridium kluyveri），但它们大多是专性厌氧菌，难以分离，这限制了传统的基因组方法用于酶的发现。相比之下，宏基因组学提供了一种无需培养的强大策略来获取这些遗传资源（Hogg等人，2024年）。这种方法提供了遗传多样性和功能序列的全面视图，同时克服了传统分离方法的局限性。通过将多代测序数据与KEGG和COG注释相结合，研究人员可以探索微生物“暗物质”，发现具有增强活性的新酶，如葡糖淀粉酶和α-淀粉酶（Santos等人，2025年；Zhang等人，2024年）。最终，宏基因组学成为揭示复杂发酵群落“代谢黑箱”的重要工具。
本研究探讨了不同富集策略（碳源、培养方法）以及来自江味白酒窖底的不同生态位样本对富集己酸产生菌的影响。宏基因组测序使得能够系统比较在不同碳源或不同生态位下富集的己酸产生菌群的微生物组成和酶谱，揭示了群落结构和代谢途径的异质性。鉴定出了己酸生物合成中的关键酶，阐明了它们的协同机制，并发现了与己酸生产相关的关键酶元件。在S. cerevisiae中异源表达这些酶证实了它们在增强酸合成中的功能。这项工作为挖掘高性能酶成分提供了有效策略，并为开发高效的己酸产生S. cerevisiae细胞工厂奠定了坚实的酶学基础。
章节片段
菌株、质粒和培养条件
本研究中使用的所有菌株和质粒均列在补充材料中（见补充材料）。
S. cerevisiae来源于AY14α，用于质粒构建的
Escherichia coli为DH5α。引导RNA使用
https://chopchop.cbu.uib.no/上的在线工具设计。质粒构建采用OK Clon DNA Ligation Kit II（Accurate Biology，中国）进行，遵循Gibson组装原理。
优化富集方法及分析江味白酒窖底己酸产生菌的产酸效率
江味白酒窖底中的微生物群落是一个通过长期驯化形成的稳定且高效的香气产生系统，其复杂性远超其他白酒（Tu等人，2022年）。在本研究中，利用热休克处理选择性地富集了产生己酸的细菌，主要是形成孢子的Clostridia，利用从窖中收集的黄水作为富集源。结论
本研究成功从江味白酒窖底富集了产生己酸的菌群，并通过宏基因组学鉴定出HBD和CAT作为产物合成的核心酶。在工程化的Saccharomyces cerevisiae中进行的功能重组表明，CAT-1显著提高了丁酸和己酸的产量，分别增加了25%和34%。结构分析和计算模拟显示，CAT-1的优异性能源于其优化的活性口袋。
CRediT作者贡献声明
Xinjian Wang：撰写——原始草稿，可视化，方法学，数据分析，概念化。Xuehui Huo：可视化，数据分析，概念化。Huannuo Hu：验证，软件，数据分析。Yumei Wang：验证，软件。Wenwen Cheng：可视化，软件。Yupeng Wang：可视化，软件。Chunhong Sun：可视化，软件。Xiaole Wu：撰写——审稿与编辑，撰写——原始草稿，监督，方法学。Yefu Chen：
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号：32572518）的支持。
