《Bioresource Technology》：High-titer
de novo raspberry ketone production in Yarrowia lipolytica via precursor supply engineering and fed-batch fermentation optimization
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树莓酮合成生物学研究：利用解脂耶氏酵母通过多拷贝途径整合和代谢调控实现高产量树莓酮生产。摘要：通过靶向整合26S rDNA的多拷贝树莓酮生物合成途径，联合强化苯丙氨酸途径、磷酸戊糖途径及脂质代谢工程，优化连续补料发酵工艺，显著提升树莓酮产量至7.24g/L，较初始菌株提高42.5倍。
李圆圆|牛书豪|王梓轩|王一晨|张晓娟|邓宇|周胜虎
江南大学生物技术学院及教育部工业生物技术重点实验室，中国无锡214122
摘要
树莓酮（RK）是一种高价值的芳香化合物，然而其微生物从头合成受到l-酪氨酸和丙二酰辅酶A（malonyl-CoA）供应不平衡的限制。本研究通过基因工程改造了Yarrowia lipolytica菌株，使其能够从葡萄糖高效合成树莓酮。将多拷贝的树莓酮合成途径整合到26S rDNA位点中，通过调节和强化莽草酸途径增加了l-酪氨酸的生成；同时优化戊糖磷酸途径并提高L-酪氨酸向p-香豆酸（PCA）的转化效率，从而增加了赤藓糖-4-磷酸（erythrose 4-phosphate）、NADPH和PCA的供应，缓解了l-酪氨酸的积累。为了解决丙二酰辅酶A的供应问题，我们增强了β-氧化途径，引入了一种非羧化途径，并减少了中性脂质的积累，使树莓酮的产量提高了1.49倍。在优化了碳源供给、初始培养基和氮补充条件的5-L连续培养过程中，树莓酮的产量达到了7.24毫克/升，比初始摇瓶培养的菌株提高了42.5倍，这也是迄今为止报道的微生物发酵中最高的树莓酮从头合成产量。
引言
树莓酮（RK，4-(4-羟基苯基)-2-丁酮）是树莓及其他浆果特有的芳香化合物，广泛用于食品调味、个人护理和营养保健品中。然而，植物组织中天然树莓酮的含量极低（通常每公斤鲜重仅含几毫克），因此通过植物栽培和提取生产“天然”树莓酮需要大量的土地和复杂的加工过程，导致成本高昂且供应有限（Gao等人，2025年；Masuo等人，2022年；Moore等人，2021年）。虽然传统的化学合成方法可以降低成本，但通常依赖石化原料和多步骤有机反应，难以满足对“天然”和“绿色”成分的监管和消费者需求（Kosjek等人，2003年）。因此，利用可再生碳源的微生物细胞工厂作为树莓酮生产的可持续替代方案受到了越来越多的关注（Gao等人，2025年；Masuo等人，2022年）。
在植物中，树莓酮通过p-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A经由苯丙素–聚酮途径合成，该途径由III型聚酮合成酶（苯乙酮合成酶）和苯乙酮还原酶催化（Moore等人，2021年；Song等人，2023年）。这一途径已在多种生物系统中被重建。在大肠杆菌（E. coli）中，通过协调增强l-酪氨酸和PCA的合成并优化下游途径的代谢流，实现了从葡萄糖的树莓酮从头合成；其他研究则通过酶级联或合成 consortia将前体生成和树莓酮合成分配到不同菌株上来减轻代谢负担（Cao等人，2023年；Masuo等人，2022年；Moore等人，2021年）。此外，担子菌Nidula niveotomentosa也被报道为天然的树莓酮生产菌（B?ker等人，2001年）。与异源细胞工厂不同，N. niveotomentosa中的树莓酮生成依赖于其自身的代谢能力，最近的研究主要通过优化浸没发酵工艺（包括系统调整培养条件和发酵参数）提高了树莓酮的产量（Zhang等人，2024年）。如Nicotiana benthamiana等植物底盘也通过重新引导内源性苯丙素代谢被改造为树莓酮的积累菌（Laurel等人，2023年）。这些及相关研究一致指出，l-酪氨酸和PCA的供应不足、丙二酰辅酶A与脂质及中心代谢的竞争以及树莓酮或其中间体的潜在毒性是目前限制树莓酮细胞工厂性能的关键瓶颈（Dickey等人，2021年；Gao等人，2025年）。
脂肪酵母Yarrowia lipolytica作为一种有前景的非传统底盘，具有GRAS安全认证、广泛的底物谱以及从乙酰辅酶A到储存脂质的天然高碳流，原则上可以支持充足的乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A供应，用于脂肪酸和聚酮类产品的生产（Madzak，2021年；Park和Ledesma-Amaro，2023年）。与其他常用的树莓酮合成宿主菌（如E. coli）相比，Y. lipolytica具有明显优势：不仅丙二酰辅酶A供应充足（Gu等人，2020年；Markham等人，2018年），而且在表达真核源基因方面表现更好（Madzak，2015年），并且对脂溶性产物的毒性具有更强的耐受性（Walker等人，2019年）。系统级研究和代谢工程表明，Y. lipolytica能够在工业相关条件下高效生产三酰甘油、有机酸和各种脂肪酸衍生物，同时保持良好的生长和抗逆性（Lee等人，2025年；Niehus等人，2018年；Park和Ledesma-Amaro，2023年）。最近，通过对莽草酸途径和芳香氨基酸合成途径的改造，实现了多种芳香天然产物的从头合成，包括黄酮类和芪类化合物，这表明Y. lipolytica也有潜力成为芳香聚酮类化合物的生产平台（Gao等人，2025年；Larroude等人，2021年；Marsan等人，2024年）。遗传工程技术的进步，尤其是高效的基因组整合和迭代多拷贝插入技术，促进了途径的快速组装和菌株优化（Larroude等人，2021年）。总体而言，Y. lipolytica具有发展成为高性能树莓酮生产细胞的巨大潜力。然而，目前尚未在Y. lipolytica中建立完整的树莓酮从头合成途径。
构建高效的Y. lipolytica细胞工厂用于树莓酮生产面临几个关键挑战。协调增强前体供应（包括l-酪氨酸、赤藓糖-4-磷酸（E4P）和NADPH）对于支持芳香化合物的合成至关重要，但这往往会对细胞生长产生负面影响或破坏氧化还原平衡（Dickey等人，2021年）。此外，脂质合成与树莓酮前体丙二酰辅酶A之间的碳分配需要精心调控（Park和Ledesma-Amaro，2023年）。过度激活脂质合成或β-氧化途径可能导致代谢流分配不当，从而限制丙二酰辅酶A用于树莓酮合成的能力（Lee等人，2025年）。综上所述，提高Y. lipolytica中的树莓酮产量需要通过协调工程来增强芳香前体的供应，同时通过最小化与脂质相关的代谢流分配来保持丙二酰辅酶A的可用性（Masuo等人，2022年；Palmer等人，2020年；Peng等人，2023年）。
本研究提出了一种高产率树莓酮从头合成的综合策略。具体而言，通过靶向26S rDNA区域构建了多拷贝的树莓酮合成途径，并进一步强化了莽草酸途径和戊糖磷酸途径，以增加l-酪氨酸、E4P和NADPH的供应。同时，通过重塑脂质代谢增强了丙二酰辅酶A的可用性，并优化了连续培养工艺，以实现高水平的树莓酮积累。这一框架实现了每升培养基生产数克的树莓酮，证明了其在Y. lipolytica中生产基于l-酪氨酸和丙二酰辅酶A的芳香化合物的可行性（详见补充材料）。
菌株、质粒和培养基
使用E. coli JM109菌株进行质粒的构建和扩增。细菌菌株在37°C下、250转/分钟的转速下，在Luria–Bertani（LB）液体培养基（10克/升NaCl、10克/升蛋白胨和5克/升酵母提取物）中培养，或在37°C下在LB琼脂平板上培养。必要时，将氨苄西林以最终浓度100毫克/升加入培养基中。野生型Y. lipolytica Po1f菌株被选为后续构建的基础菌株。
在Y. Lipolytica中构建树莓酮从头合成途径
在之前的研究中，我们已经确定PCA是树莓酮合成途径中的关键前体，持续提高PCA的水平可以增强树莓酮的生成（Zhou等人，2024年）。鉴于Y. lipolytica能够从葡萄糖合成酪氨酸，因此可以通过将酪氨酸转化为PCA来实现PCA的头合成。为此，将F. johnsoniae中的FjTAL基因多拷贝整合到Y. lipolytica的26S rDNA位点中，并在强表达条件下进行表达。
结论
树莓酮在香料和食品工业中具有重要的价值。本研究通过逐步优化途径和工艺，对Yarrowia lipolytica进行了工程改造，实现了树莓酮的头合成。首先建立了树莓酮从头合成途径，在摇瓶培养中获得了170.2毫克/升的树莓酮产量。通过强化莽草酸途径增加了l-酪氨酸的供应，树莓酮产量达到373.2毫克/升，同时积累了1,270.6毫克/升的l-酪氨酸。进一步强化戊糖磷酸途径后，通过提高E4P的水平，树莓酮产量进一步提高至548.3毫克/升。
作者贡献声明
李圆圆：撰写原始稿件、方法学设计、实验研究、概念构思。
牛书豪：撰写原始稿件、数据验证、实验研究。
王梓轩：数据可视化、结果验证、实验研究。
王一晨：数据可视化、结果验证、实验研究。
张晓娟：撰写原始稿件、项目管理、数据整理。
邓宇：撰写、审稿与编辑、监督工作、资源协调。
周胜虎：撰写、审稿与编辑、监督工作、资源协调、项目管理。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家重点研发计划（2024YFA0918000）、国家自然科学基金（22378170和22478156）以及江苏省前沿技术研发计划（BF2025080）的支持。
