一种双模式纸质微流控传感器阵列，在中性pH条件下具有高过氧化物酶样活性，可用于现场监测阿片类药物的治疗效果

《Bioscience Reports》：A dual-mode paper-based microfluidic sensor array with high peroxidase-like activity at neutral pH for on-site therapeutic drug monitoring of opioids

便携式双模微流控纸基传感器用于高灵敏吗啡检测。该传感器基于HA@Co-m-CeO?纳米酶，实现比色法和电化学法协同检测，检测限4.3×10?3 μg/mL，适用于术后疼痛管理和药物监测。

　　

罗忠辉|王军|李超|何俊林|胡建伟|陈思婷|何穗穗|魏华|余翠云

湖南省衡阳医学院；中南大学第一附属医院药学院分子靶点新药研究合作创新中心；中国湖南省衡阳市常胜路28号，421001

摘要

阿片类药物是一类在临床实践中不可或缺的强效镇痛剂，为了有效进行术后疼痛管理、癌症疼痛控制以及药物成瘾诊断，需要对其实施精确监测。开发一种简单、可扩展且能实时监测阿片类药物浓度的系统对于简化并加速患者筛查流程具有重要意义。为此，我们报道了一种便携式、可视化且多模式的纸质微流控传感器阵列，用于检测阿片类药物。该传感器阵列采用可折叠设计，检测区域涂有透明质酸改性的氧化铈纳米复合材料（HA@Co-m-CeO₂），这种材料在中性pH条件下表现出强大的过氧化物酶样活性和电催化性能，能够实现模型分析物吗啡（MO）的双模式比色和电化学检测。在比色分析中，吗啡的存在会抑制过氧化物酶样的催化显色反应，导致蓝色信号减弱。在电化学分析中，HA@Co-m-CeO₂由于优异的电催化活性和强静电吸附作用，对吗啡产生放大的电化学响应。利用这种双重催化功能，该传感器阵列能够在中性pH条件下实现吗啡的便携式双模式检测，检测范围为0.01–300 μg/mL，检测限低至4.3 × 10^–3 μg/mL，不仅优于以往报道的单模式比色或电化学纸质设备，还通过双信号输出提高了检测的准确性和可靠性。总体而言，本研究开发了一种简单、可扩展且可转移的纸质传感器阵列，可作为非侵入性、高灵敏度的多模式分析工具，应用于治疗药物监测（TDM）过程。

引言

阿片类药物的滥用已成为一个严重的全球公共卫生问题。过去十年中，全球阿片类药物的消费量增长了76% [1]。根据美国的数据报告，2010年至2022年间，因阿片类药物过量导致的呼吸抑制死亡人数几乎增加了四倍 [2]。吗啡（MO）是一种关键的阿片类药物，在全球范围内被广泛用作强效镇痛剂 [3]。尽管在临床实践中不可或缺，但其使用也与多种潜在的不良反应相关，包括心动过缓、全身无力、中枢神经系统抑制和呼吸停止 [4]。此外，长期使用吗啡还会增加个体对生理和心理依赖的风险 [5]。鉴于全球吗啡使用量的持续增加，迫切需要开发一种高效的筛查方法，以便快速在现场评估患者的用药依从性，从而支持及时的干预和治疗决策。治疗药物监测（TDM）通过监测血液或其他生物样本中的药物浓度，在药代动力学和药效学的指导下优化剂量策略，从而提高药物治疗的有效性和安全性 [6]、[7]。因此，开发一种快速、灵敏且成本效益高的TDM方法对于个性化治疗和精准医疗具有重要意义，同时也能降低药物滥用的风险。

传统的药物检测和定量方法主要包括气相色谱法、高效液相色谱法、质谱法及其组合方法 [8]、[9]。尽管这些方法在药物分析中表现出高灵敏度和选择性，但仍存在一些关键的限制，如设备成本高、需要专业人员以及劳动力和试剂消耗量大 [10]、[11]。相比之下，微流控纸质分析设备（μPAD）由于易于获取、设计紧凑且具有实时响应能力，成为便携式和现场检测目标分析物的有希望的替代方案 [12]、[13]、[14]、[15]。目前的μPAD主要利用比色法产生可视化的信号，用于定性或半定量评估 [16]。尽管在操作简便性和结果可视化方面取得了巨大进展，但依赖单一模式的视觉读数使得大多数μPAD容易受到主观解释和背景干扰的影响，可能导致分析准确性和可靠性下降 [17]、[18]。

集成两种独立信号响应机制的双模式分析系统可以相互验证检测结果，从而显著提高分析数据的可靠性 [19]、[20]。因此，将双模式传感策略整合到单一μPAD平台中，有望提高检测结果的稳健性和准确性 [21]、[22]、[23]。电化学检测技术因其低成本、快速响应、高灵敏度和良好的可控性等优点，成为一种非常有前景的TDM方法 [24]、[25]、[26]、[27]。通过印刷、手写、过滤和热解等成型技术，可以在纸质基底上制备适合电化学分析的微电极结构 [28]、[29]、[30]。然而，迄今为止报道的大多数功能性纳米传感器仅限于通过比色或电化学方法实现吗啡的单模式检测 [31]、[32]、[33]、[34]、[35]、[36]。据我们所知，目前尚未开发出兼具用户友好性、成本效益和高灵敏度的比色-电化学双模式μPAD平台。

为此，开发具有优异比色性能和电催化活性的多功能纳米传感器是必要的前提。纳米酶是一种具有酶样催化特性的纳米材料，能够有效模拟天然酶的催化行为 [37]、[38]、[39]、[40]。由于其低成本、高稳定性、可调的表面性质和良好的生物相容性，纳米酶已被广泛用于多模式传感系统中的催化信号放大组件 [41]、[42]、[43]。特别是3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）–H₂O₂比色系统，在过氧化物酶样纳米酶的催化下，已被广泛应用于化学和生物传感以及临床诊断 [44]、[45]、[46]、[47]、[48]。然而，大多数过氧化物酶样纳米酶在酸性条件（pH 3.0–5.0）下表现出最佳催化性能，而天然酶通常在中性生理条件（pH 7.0–7.4）下发挥作用 [19]、[49]。这种不匹配极大地限制了酶-纳米酶级联检测系统的应用范围。为了提高过氧化物酶样纳米酶在中性pH条件下的催化效率，人们进行了大量研究，包括设计和开发各种纳米材料，如碳纳米材料 [50]、金属-有机框架 [51]、贵金属纳米颗粒 [52] 和过渡金属氧化物 [53]。在这些候选材料中，二氧化铈（CeO₂）纳米颗粒因其可调节的形态和晶相、丰富的氧空位以及可逆的Ce³⁺/Ce⁴⁺氧化还原对而成为有前景的过氧化物酶模拟物 [54]。不幸的是，与天然过氧化物酶相比，纯CeO₂的过氧化物酶样活性不足 [19]。为了克服这一限制，人们探索了多种策略，主要集中在控制形态和晶相结构、施加外部刺激以及掺杂合适的金属元素 [55]。最近，Nguyen等人利用密度泛函理论模拟了钴掺杂的介孔CeO₂纳米复合材料，发现其在接近中性pH（pH = 6）下的催化效率比未掺杂的介孔CeO₂高出约600倍 [56]。钴掺杂不仅促进了晶格氧的迁移，增加了氧空位的浓度，还降低了氧空位的形成能，生成了更多的活性位点 [57]。这些结构和电子优势使钴掺杂的CeO₂具有更优异的电催化性能，显著提高了电化学检测的灵敏度。受这些进展的启发，将高活性的钴掺杂CeO₂纳米酶与μPAD平台结合，是一种有前景但尚未探索的策略，可以增强比色-电化学双模式检测系统的灵敏度和应用范围。

为此，我们开发了一种基于比色和电化学双信号输出的折纸μPAD，用于快速、高灵敏度和现场定量检测吗啡（图1）。所开发的双模式μPAD传感平台采用透明质酸包覆的钴掺杂介孔CeO₂（HA@Co-m-CeO₂）纳米酶作为双功能纳米传感器。在比色分析中，HA@Co-m-CeO₂在中性pH条件下表现出显著的过氧化物酶样活性，有效催化TMB在H₂O₂存在下的氧化生成oxTMB。随后加入吗啡会吸附在HA@Co-m-CeO₂表面，抑制其酶样活性并竞争H₂O₂产生的活性氧物种。在电化学分析中，HA@Co-m-CeO₂由于优异的电催化活性和强静电吸附作用，对吗啡表现出增强的电化学响应。利用HA@Co-m-CeO₂的双重催化功能，该μPAD传感平台实现了在中性pH条件下的便携式双模式检测。通过分析真实的人类尿液样本，进一步验证了该平台的实用性和可靠性。因此，所开发的双模式μPAD传感平台作为一种经济实惠且用户友好的TDM方法，在生物样本中实现吗啡的现场和实时检测方面具有巨大潜力。

部分内容

HA@Co-m-CeO₂的合成

Co-m-CeO₂纳米颗粒的合成方法参考了先前报道的方法 [19]。简要来说，将1.8 g的Ce(NO₃)₃·6H₂O和139 mg的Co(NO₃)₂·6H₂O溶解在20 mL乙醇中，然后加入1 g的介孔二氧化硅。混合物经过超声处理以确保完全分散和均匀混合。随后将溶液加热并在50°C下搅拌以蒸发剩余的溶剂。所得固体转移到真空干燥箱中

材料表征

Co-m-CeO₂纳米颗粒通过硬模板法合成，随后通过静电相互作用与透明质酸结合，制备出透明质酸包覆的HA@Co-m-CeO₂。通过扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）分析了所得纳米材料的形态特征。Co-m-CeO₂呈现球形形态，平均粒径约为419.4 nm（图1a、b和S1a）。

结论

总之，我们开发了一种基于比色和电化学双信号输出的折纸μPAD传感平台，用于快速、灵敏和现场定量检测吗啡。该双模式μPAD传感平台采用HA@Co-m-CeO₂纳米酶作为双功能纳米传感器。在比色分析中，HA@Co-m-CeO₂表现出显著的过氧化物酶样活性，在H₂O₂存在下有效催化无色TMB氧化为蓝色oxTMB

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文工作的利益冲突。

CRediT作者贡献声明

李超：正式分析、数据管理。王军：撰写初稿、可视化、验证、方法学设计、实验研究、正式分析、数据管理。何俊林：正式分析、数据管理。余翠云：撰写与编辑、监督、项目管理、资金争取。罗忠辉：撰写初稿、可视化、验证、方法学设计、实验研究、正式分析、数据管理、概念构思。陈思婷：正式分析、数据管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢以下机构的支持：国家自然科学基金（22101127）、湖南省科技创新领军人才项目（2022RC3080）、湖南省重点研发计划（2021SK2036）、湖南省卫生健康委员会的科研项目（202213024185和202213024688）、湖南省自然科学基金（2023JJ40529和2024JJ6373），以及湖南省教育厅的资助