《Applied Biological Chemistry》：A covalently crosslinked alginate hydrogel platform with alginate oligosaccharide for tunable mechanics and enhanced antibacterial function
编辑推荐：
本文报道了一种利用共价交联和AOS功能化构建的稳定海藻酸盐水凝胶平台。研究表明，与Ca2+离子交联的传统水凝胶相比，该共价交联凝胶可克服离子浸出问题，并提供可调节的力学性能（2–5 kPa，~40%滞后）以适配皮肤弹性。通过将抗菌肽（AMP）GNU7固定于凝胶表面并引入AOS，可显著增强其抗菌效能。此平台为开发兼具结构稳定、良好顺应性及高效抗菌性能的新一代功能性伤口敷料提供了潜在方案。
引言：伤口愈合与敷料材料的发展
伤口愈合是一个涉及止血、炎症、增殖和成熟四个重叠阶段的复杂过程。理想的伤口敷料不仅是物理屏障，更应提供适宜的弹性、湿润环境和无菌条件以模拟生理环境。过于干燥会抑制细胞迁移与增殖，而慢性伤口中过高的湿度则可能导致蛋白水解酶和促炎细胞因子积累，反而延迟愈合。因此，敷料材料的性能对愈合周期和质量至关重要。
水凝胶因其高弹性、高溶胀比和快速溶质传输能力，被视为理想的生物医学平台。海藻酸盐作为一种从褐藻中提取的天然多糖，因其良好的生物相容性和成胶能力而备受关注。传统的海藻酸盐水凝胶通过二价阳离子（如Ca2+）进行离子交联，形成“蛋盒”结构。然而，这种方法存在显著局限性。首先，离子交联的力学性质受海藻酸盐M/G块比例的影响很大，而M/G比例因海藻来源、生长条件及提取方法不同而变化，导致凝胶性质不一，再现性和规模化受限。其次，凝胶中的钙离子在生理条件下会逐渐浸出，可能通过诱导线粒体通透性转换和活性氧生成而引发细胞毒性效应。再者，离子交联凝胶在受力时主要通过离子键的断裂与重组来释放应力，这种塑性形变在伤口部位等动态环境中可能损害结构完整性。
为克服这些限制，本研究开发了一种基于EDC（1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺）和NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）化学的共价交联海藻酸盐水凝胶。该方法使用氨基酸基交联剂，无需二价离子即可形成稳定的网络结构，避免了离子浸出问题。尽管高浓度EDC具有细胞毒性，但已有研究表明，在胶原基水凝胶中，浓度高达0.5 M的EDC并未显著影响细胞活力。
除了改进力学性能，本研究还聚焦于将功能性生物分子掺入或固定到水凝胶中。海藻酸寡糖是本研究引入的关键功能分子。AOS是一种源自海藻酸的低分子量寡糖，具有多种生物活性。在本研究中，AOS主要作为支架用于调控水凝胶性质并放大共固定化功能试剂的活性，而非利用其固有生物活性。
为使水凝胶具备抗菌功能，其表面被功能化固定了抗菌肽GGG-GNU7。细菌感染会刺激白细胞介素-1β等炎症因子的释放，从而延长伤口愈合的炎症期。在此期间，免疫细胞会产生过量的活性氧来对抗病原体，可能导致对宿主细胞和细胞外基质成分的非特异性损伤，进而影响组织再生，可能导致疤痕形成或慢性伤口。抗菌肽因其阳离子电荷和α-螺旋结构，可与细菌膜发生静电相互作用，并通过类似表面活性剂的两亲性机制破坏膜结构。这种非特异性膜靶向作用使其对包括耐药菌在内的多种病原体都有效。将抗菌肽固定在水凝胶基质上，可以保持其局部活性而不发生扩散损失，部分研究报道其抗菌效果可持续数天。
因此，本研究旨在开发一种共价交联海藻酸盐水凝胶，并通过与AOS偶联来考察其水相关和力学性质的变化，同时通过固定抗菌肽实现更好的功能化。水相关行为通过测定溶胀比和保水能力来评估。力学性能则通过单轴压缩试验获得的杨氏模量和滞后能量耗散来评估。在确定了所选抗菌肽对代表性细菌的最小抑菌浓度后，将肽共价固定在凝胶表面，并通过接触抑制试验验证其抗菌功效。
材料与方法
水凝胶制备采用EDC/NHS共价交联法。将2%的海藻酸盐溶液溶解在MES缓冲液中，依次加入交联剂、EDC和NHS。海藻酸寡糖以相对于海藻酸盐重量0.1-4%的浓度范围加入并一起溶解。离子交联水凝胶则使用碳酸钙和葡糖酸-δ-内酯作为缓慢酸化剂制备。使用甲酯化的赖氨酸作为交联剂时，需先对赖氨酸的羧基进行甲基化处理。
水凝胶的最大持水能力通过将其浸泡在磷酸盐缓冲液中直至重量不再变化来测定。干燥重量通过风干并在60℃烘箱中干燥24小时获得。再溶胀能力则通过将完全干燥的凝胶再次浸入PBS中并定时称重来评估。凝胶的压缩模量使用配备500 N载荷传感器的万能试验机在10 mm/min的速度下进行单轴压缩测试，并根据初始5-15%应变区间的线性斜率计算。滞后比通过将凝胶压缩至30%应变然后卸载，根据加载和卸载曲线所围面积计算。
抗菌肽选择了GGG-GNU7。为促进共价固定并在海藻酸主链和功能肽之间提供空间间隔，在其N端引入了短甘氨酸间隔基。通过连续稀释法评估了GGG-GNU7对大肠杆菌DH5α和江苏伊丽莎白菌的最小抑菌浓度。为将肽固定在水凝胶表面，先用EDC/NHS溶液激活凝胶，然后加入肽溶液孵育，最后洗去未结合的肽。抗菌活性通过将细菌接种到功能化凝胶表面孵育，然后涂板计数菌落来评估。
水凝胶的微观结构通过冷冻干燥和铂溅射涂层后，使用场发射扫描电子显微镜在10 kV加速电压下进行表征。所有数据均以平均值±标准差表示，统计差异采用单因素方差分析和Tukey多重比较检验进行评估。
结果与讨论
水凝胶的形貌
无论采用离子还是共价交联，所有水凝胶的宏观外观均具有可比性。交联桥材料（乙二胺、甲酯化赖氨酸）或不同浓度的AOS均未引起明显的视觉差异。水凝胶制备方法对宏观形态无显著影响。
2?-mediated ionic gelation or by covalent crosslinking with EDA or Me-Lys, with or without AOS">
水凝胶的溶胀行为和保水能力
离子交联水凝胶在平衡溶胀时，含水量约为其干重的3000%，而共价交联水凝胶的溶胀比则较低，约为2000%。在空气干燥过程中，所有配方的水凝胶都表现出相似的失水速率。然而，完全干燥后，再水化行为出现了显著差异。共价交联水凝胶恢复其原始溶胀能力的能力明显低于离子交联凝胶。此外，AOS的掺入进一步降低了再溶胀比，AOS含量越高，干燥后的吸水能力越低。
这些结果表明，虽然离子和共价海藻酸盐水凝胶都具有较高的初始含水量，但它们对脱水的结构响应存在本质不同。共价交联水凝胶再水化能力的降低很可能归因于脱水过程中聚合物网络的不可逆塌陷和致密化，这破坏了内部孔隙结构和毛细管通路。这种效应在化学交联水凝胶中常见，其中共价连接点限制了链的流动性，并限制了再水化时的网络扩张。AOS的存在可能通过增加分子间相互作用或占据聚合物基质内的自由体积，从而在再溶胀过程中阻碍孔隙的重新打开，进一步促进了这种行为。
从应用角度来看，这些水合特性表明，共价交联的海藻酸盐水凝胶（特别是掺入AOS的凝胶）更适合需要持续保湿而非反复干湿循环的伤口环境。这种特性对于渗出少或干燥的伤口可能是有利的。相比之下，离子交联海藻酸盐水凝胶较高的再水化能力支持其继续用于高渗出性伤口。
水凝胶的压缩模量与滞后
共价交联水凝胶的压缩模量在2–5 kPa范围内，而离子交联水凝胶的模量显著更高，为184.5 kPa，增加了约40倍。这种显著差异反映了共价网络和离子网络根本不同的承力机制。虽然离子交联凝胶提供了较强的抗变形能力，但过高的刚度可能阻碍其适应动态的皮肤运动，并可能因敷料与伤口界面间的摩擦而增加不适或继发性组织损伤的风险。相比之下，健康人体皮肤的弹性模量通常在5-100 kPa范围内，共价交联水凝胶的模量更接近这一生理相关窗口，表明其皮肤顺应性更好，更适合伤口敷料应用。
能量耗散行为通过单次加载-卸载压缩循环进行评估。共价交联水凝胶表现出相对较低的滞后比，约为40%，表明其高效的弹性储能和有限的不可逆形变。相比之下，离子交联水凝胶的滞后比高出约20个百分点，反映了变形过程中明显更大的能量耗散。
这种差异可归因于离子交联的可逆性，施加的机械能被消耗在离子键的反复断裂和重组中，而不是弹性地储存在网络中。因此，离子交联水凝胶经历更大的机械能损失，并且在循环加载下更容易疲劳。这种行为可能加速长期结构退化，并限制其在动态生物医学环境中的耐久性，而共价交联水凝胶在反复机械应力下能保持结构完整性。
固定抗菌肽的水凝胶的抗菌活性
GGG-GNU7肽的固有抗菌活性首先通过最小抑菌浓度测定进行评估。对于大肠杆菌DH5α和江苏伊丽莎白菌，肽浓度≥2 μM时均观察到完全的生长抑制。在较低浓度下，检测到部分抑制，显示出明显的剂量依赖性抗菌反应。
将GGG-GNU7表面固定后的抗菌性能通过将其在不同浓度下共价固定在凝胶表面并进行测试来评估。固定了乱序对照肽的凝胶在所有测试肽浓度下均未显示出可测量的抗菌活性。相比之下，固定了GGG-GNU7的凝胶显示出明确的浓度依赖性抗菌效果。值得注意的是，掺入4% AOS进一步增强了所有测试肽浓度下的抗菌性能。在相同的固定肽剂量下，细菌生长抑制率有所提高。这种增强在较低的肽浓度下尤为明显，抗菌活性几乎翻倍。
这些发现表明，AOS作为一种有效的共基质成分，能够放大固定化抗菌肽的功能性能。在水凝胶基质内，AOS可能作为一种柔性间隔物，增加了固定化肽的有效作用范围和暴露度，可能促进了阳离子抗菌肽与细菌膜之间的相互作用。这种利用海藻酸盐-海藻酸寡糖杂化基质来增强功能生物活性的方法此前探索较少，本研究结果表明该平台可以显著提高表面固定化肽的抗菌功效。
E. coli DH5α and I. jiangsuensis, respectively. (C) growth-inhibition efficiencies of peptide-conjugated hydrogels against E. coliDH5α. (D) representative TSA plates after 16 h incubation with different concentrations of immobilized antimicrobial peptide.">
水凝胶的微观形态
通过扫描电镜检查了水凝胶的内部微观结构。离子交联水凝胶呈现出相对致密且紧密堆积的孔结构，而共价交联水凝胶则显示出更大、更开放的孔隙网络。这种微观结构差异与压缩测试中观察到的力学性能一致。通常，具有更细密孔结构的水凝胶往往表现出更高的弹性模量；因此，离子交联凝胶的致密网络为其相较于共价交联对应物显著更高的压缩模量提供了结构基础。
这些不同的形态及其相关的力学行为源于根本不同的交联机制。离子交联通过可逆的离子-聚合物相互作用介导形成局部连接点，导致网络区域紧密堆积；而共价交联则产生更均匀、更灵活的聚合物网络，具有更大的孔隙开放性。这些观察结果共同支持了交联策略在决定水凝胶微观结构、进而影响其宏观力学性能方面起着关键作用的结论。
结论
本研究开发了一种共价交联的海藻酸盐/海藻酸寡糖水凝胶平台，旨在实现具有机械顺应性和抗菌性能的伤口敷料。与传统Ca2+离子交联海藻酸盐水凝胶相比，该共价网络有效消除了离子浸出，表现出更低的溶胀度，并展现出2–5 kPa的压缩模量和约40%的滞后比——这些数值接近人体皮肤弹性的较低生理范围。虽然掺入AOS降低了整体溶胀能力，但保水能力并未受到实质性损害。在凝胶表面固定阳离子抗菌肽GGG-GNU7，对两种不同类型的细菌均产生了明确的剂量依赖性抗菌活性。值得注意的是，掺入AOS显著增强了抗菌功效，在100 μM肽浓度下，生长抑制率几乎翻倍。这种增强可能与AOS基质内固定化肽的空间呈现及其与细菌膜的局部相互作用得到改善有关。总而言之，这些结果表明，将AOS整合到共价交联海藻酸盐水凝胶中，可以同时实现力学性能的调节和抗菌功能的放大。这种简单而通用的策略为设计具有改进的结构稳定性、皮肤顺应性和抗菌性能的新一代伤口敷料提供了一个前景广阔的平台。
