《Cancer Letters》：Starvation-induced LHFPL3-AS2 promotes MAPKAP K2-dependent phosphorylation of hnRNPA0 and progression of esophageal squamous cell carcinoma
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食管鳞癌血清剥夺诱导的致癌lncRNA LHFPL3-AS2通过结合hnRNPA0激活MK2磷酸化，稳定BMP7 mRNA促进免疫抑制表型，揭示肿瘤进展新机制。
袁旭|张子琦|杨艳婷|李敏欣|王海鹏|张龙|王守宇|任传利|张娜莎|李增军|杨明
山东省精准肿瘤学重点实验室，山东省肿瘤医院暨研究所癌症研究中心，山东第一医科大学和山东省医学科学院，中国济南250117
摘要
食管鳞状细胞癌（ESCC）仍然是全球癌症相关死亡的主要原因之一。长链非编码RNA（lncRNAs）在ESCC的进展中起着关键作用。在这项研究中，我们分析了ESCC细胞在血清缺乏条件下的lncRNA表达情况，并发现LHFPL3-AS2是一种由血清饥饿诱导的致癌lncRNA。LHFPL3-AS2能够在体外和体内促进ESCC细胞的侵袭和转移。其机制在于，LHFPL3-AS2直接与hnRNPA0蛋白结合，增强其与激酶MAPKAP-K2（MK2）的相互作用，并促进hnRNPA0在第84位丝氨酸处的磷酸化。磷酸化的hnRNPA0与多种致癌转录本结合，如BMP7 mRNA，稳定这些mRNA并提高它们在ESCC细胞中的表达水平。重要的是，LHFPL3-AS2通过上调癌细胞分泌的BMP7，促使巨噬细胞向免疫抑制的M2表型极化，从而促进肿瘤的免疫逃逸和ESCC的进展。总体而言，我们的研究发现了在血清饥饿条件下一个先前未被重视的LHFPL3-AS2-MK2-hnRNPA0-BMP7轴，为ESCC的发病机制提供了新的见解。
引言
食管癌是最常见的恶性肿瘤之一，也是全球癌症相关死亡的第七大原因[1]。食管癌有两种组织学亚型：食管腺癌（EAC）和食管鳞状细胞癌（ESCC）[2]。值得注意的是，ESCC在东亚、南亚和中亚以及南非地区具有明显的地理优势，占这些地区所有食管癌病例的约90%[2, 3]。ESCC的主要致病因素包括长期使用烟草和酒精、营养不良、亚硝胺暴露以及摄入刺激性或粗糙的食物[3]。尽管针对ESCC的各种疗法已取得显著进展，但晚期ESCC患者的5年生存率仍仅为15%[2, 4]。因此，了解ESCC进展的分子机制非常重要。
长链非编码RNA（lncRNAs）长度超过200个核苷酸，不具备蛋白质编码能力，可以作为多维调控元件[5]，包括帮助哺乳动物细胞适应各种营养缺乏环境[6, 7]。先前的研究表明，lncRNA GAS5在生长因子缺乏或血清饥饿的情况下上调，从而抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡[8]。此外，LINC01615作为一种由营养缺乏诱导的lncRNA，可通过G6PD介导的PPP激活促进结直肠癌细胞的存活，并协同增强奥沙利铂的敏感性[9]。这些发现表明，lncRNAs可能在营养缺乏条件下帮助细胞适应。然而，癌细胞如何抵抗营养缺乏的精确机制仍大部分尚未明确。
RNA结合蛋白（RBPs）是RNA代谢的关键调控因子，涉及RNA剪接、RNA切割、RNA多聚腺苷化、RNA转运、RNA翻译和RNA降解[10]。越来越多的证据表明，失调的RBPs及其相关的lncRNAs在肿瘤发生和癌症进展中起着关键作用[11]。例如，DGCR5已被确定为一种在ESCC中具有致癌性的lncRNA，它与SRSF1蛋白结合并稳定其功能，从而增强可变剪接事件并促进肿瘤发展[12]。同样，TRA2A蛋白与lncRNA MALAT1相互作用，调节EZH2/β-连环蛋白信号通路，促进ESCC的增殖和迁移[13]。我们还发现，TDP-43作为RBP在转录后水平上稳定TP63 mRNA，显著增强TP63的表达[14]。这些发现强调了RBP在ESCC发病机制中的重要性，并突显了它们作为治疗靶点的潜力。
在本研究中，我们发现了LHFPL3-AS2这种在ESCC细胞中由血清饥饿诱导的lncRNA。LHFPL3-AS2能够在体外和体内促进ESCC细胞的侵袭和转移。其机制在于，LHFPL3-AS2直接与hnRNPA0蛋白结合，增强其与激酶MAPKAP-K2（MK2）的相互作用，并促进hnRNPA0在第84位丝氨酸处的磷酸化。磷酸化的hnRNPA0与多种致癌转录本结合，如BMP7 mRNA，稳定这些mRNA并提高它们在ESCC细胞中的表达水平。有趣的是，LHFPL3-AS2通过上调癌细胞分泌的BMP7，促使巨噬细胞向免疫抑制的M2表型极化，从而促进肿瘤的免疫逃逸和ESCC的进展。总体而言，我们的数据揭示了ESCC进展中一个先前未被重视的LHFPL3-AS2-MK2-hnRNPA0-BMP7轴。
实验方法
细胞培养和转染
人类KYSE-30、KYSE-180和HEK293T细胞在DMEM培养基（Gibco，美国）中培养。人类THP-1细胞在RPMI 1640培养基（Gibco，美国）中培养。所有培养基均添加了10%胎牛血清（FBS；Gibco，1347575），具体方法如前文所述[15]。进行血清饥饿处理时，细胞先用PBS洗涤两次，然后培养在不含FBS的培养基中。细胞在37°C、5% CO?的培养箱中培养，并定期检测其无菌状态。血清饥饿条件下ESCC中LHFPL3-AS2的表达上调
为了研究血清饥饿条件下lncRNAs在ESCC中的作用，我们对在标准培养基或无血清培养基中培养的ESCC KYSE-30、KYSE-180和KYSE-510细胞进行了基因表达分析（图1A）。无血清培养基是一种公认的营养缺乏模型[22]。转录组分析确定了三种对营养缺乏有响应的lncRNAs（LHFPL3-AS2、HFE-AS1和LOC102723716）（|log?FC| > 4.5，P < 10??），其中LHFPL3-AS2最为显著。
讨论
营养缺乏，包括血清饥饿，是肿瘤微环境（TME）的特征，其特征是恶性细胞快速增殖和血管化不足。这种代谢压力迫使肿瘤细胞发展出适应性机制以维持生存和生长。与此一致的是，葡萄糖饥饿会诱导lncRNA TRINGS的上调，后者可防止结直肠癌细胞的坏死[32]。类似地，lncRNA RMEL3也表现出类似的作用。
CRediT作者贡献声明
王海鹏：数据可视化、资源准备、正式分析、数据管理。李敏欣：研究监督、软件使用、资源协调。杨艳婷：初稿撰写、数据可视化、验证、研究监督、数据管理。张子琦：数据验证、软件使用、方法设计、正式分析。袁旭：软件使用、方法设计、实验研究。杨明：文章撰写与编辑、资金申请、概念构思。李增军：数据验证、软件使用、资源协调、数据管理。任传利：软件使用、资源协调。
资助
本研究得到了国家自然科学基金（82573904、82372760、82303135和82403201）、山东省自然科学基金（ZR2024MH099、ZR2024QH254和ZR2023QC277）、山东省泰山学者计划（tsqn202211340和tstp20221141）、新兴战略领域科学研究培育项目（202404）、山东肿瘤医院协同学术创新项目（TS008）以及北京科创医疗发展基金的支持。
