MAP4K4 调节胰腺肿瘤微环境的免疫特征，并为免疫疗法提供了可能性

《Cancer Letters》：MAP4K4 Regulates the Immune Landscape of Pancreatic Tumor Microenvironment and Provides an Opportunity for Immunotherapy

胰腺癌免疫微环境中MAP4K4通过调控巨噬细胞和粒细胞浸润及T细胞功能，联合4-1BB激动抗体显著增强抗肿瘤免疫应答。

　　

Sunil Kumar Singh | Sandeep Kumar | Saket Jha | Navin Viswakarma | Harsh Vyas | Piush Srivastava | Rakesh Sathish Nair | Sowdhamini Mahendiran | Niraj Nag | Periannan Sethupathi | Basabi Rana | Jose Trevino | Ajay Rana

伊利诺伊大学芝加哥分校医学院外科系，美国伊利诺伊州芝加哥市南伍德街840号，邮编60612

摘要：

由于胰腺导管腺癌（PDAC）对传统疗法具有广泛的抗性，预计到2030年它将成为美国癌症相关死亡的第二大原因。PDAC治疗失败的主要障碍之一是存在免疫抑制性的肿瘤微环境（TME）。本文报道了MAP4K4在调节PDAC-TME中的先天性和适应性免疫中的作用。免疫组化分析显示，MAP4K4的过表达增强了巨噬细胞和中性粒细胞对肿瘤的浸润，同时减少了KPC PDAC肿瘤中的T细胞数量。此外，用MAP4K4抑制剂GNE-495治疗KPC小鼠后，肿瘤浸润的巨噬细胞和中性粒细胞数量减少，T细胞数量增加。RT2 PCR阵列分析表明，GNE-495治疗降低了外周T细胞和肿瘤浸润T细胞中共刺激受体4-1BB基因的表达。GNE-495与4-1BB激动型单克隆抗体（mAb）联合使用显示出最大的细胞毒性T细胞效应和肿瘤消退，并提高了KPC小鼠的生存率。我们的研究表明，MAP4K4调节胰腺TME中的先天性和适应性免疫细胞，而MAP4K4的抑制剂可以减少肿瘤中的巨噬细胞和中性粒细胞数量。此外，将MAP4K4抑制剂与4-1BB激动型单克隆抗体结合使用可诱导T细胞介导的抗肿瘤反应，这种组合可能成为PDAC的有效治疗方法。

引言

胰腺癌仍然是全球最致命的癌症之一[1]、[2]。胰腺导管腺癌（PDAC）是最常见的胰腺癌类型，5年生存率仅为13%，并且在过去三十年中一直保持不变[3]、[4]。超过90%的PDAC患者存在KRAS突变，导致KRAS激活，进而引发持续增殖、抗凋亡、间质重塑、转移和化疗耐药性[5]。最近报道了一种针对突变型KRAS（尤其是KRAS-G12D）的有效方法，并已在PDAC的临床试验中使用[6]。然而，对KRAS-G12D抑制剂的耐药性很常见[7]，这凸显了寻找新的治疗途径的必要性。免疫疗法已成为治疗许多晚期癌症（包括胰腺癌）的可行选择[8]。然而，在胰腺癌中，由于肿瘤的低抗原性和促肿瘤微环境（TME）的存在，免疫疗法未能显示出显著疗效[2]。针对程序性死亡配体1（PD-L1）的检点抑制剂（ICI）已在多种癌症中获得临床应用许可；但由于多种原因，其在PDAC中的效果并不理想[9]。因此，确定替代靶点对于发挥免疫疗法在PDAC中的优势至关重要。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的激活在胰腺癌中很常见[10]、[11]。最近，我们报道了两种MAPK上游调节因子（MLK3和MAP4K4）在胰腺癌中的调节作用[12]、[13]。Ser/Thr激酶MAP4K4在多种疾病中发挥重要的生理功能，并受TNFα的调节[14]。MAP4K4在多种癌症中表达上调，包括人类PDAC组织[13]、[15]、[16]，并且高MAP4K4表达与较差的患者预后相关[17]。还有研究表明，MAP4K4表达可作为PDAC的预后标志物。用MAP4K4抑制剂（GNE-495）治疗PDAC动物模型（KPC小鼠）可以改善胰腺癌[13]。MAP4K4抑制在胰腺肿瘤发生中的作用已有充分文献记载；然而，MAP4K4如何调节胰腺TME及其与免疫疗法的关联尚未明确。

免疫疗法已成为治疗许多晚期癌症的替代和可行选择[8]、[18]；然而，迄今为止在胰腺癌中尚未显示出疗效[19]。越来越多的证据表明，胰腺癌TME存在多种免疫缺陷。胰腺癌的第一个免疫缺陷是TME中缺乏效应T细胞[20]、[21]。胰腺TME中浸润的CD8⁺ T细胞数量明显少于其他“热”癌症[22]。第二个免疫缺陷是存在致密的间质/纤维化，这阻碍了效应免疫细胞到达肿瘤细胞[23]、[24]。第三个免疫缺陷是免疫抑制性的TME，其中以髓系细胞（包括巨噬细胞）为主[25]。第四个免疫缺陷是T细胞上免疫检查点蛋白的上调[22]。为了克服这些免疫缺陷，提出了一种合理的序贯组合疗法，通过管理胰腺TME来促进抗肿瘤反应。

在本研究中，我们发现MAP4K4调节免疫细胞向肿瘤的浸润，而GNE-495对MAP4K4的抑制剂作用可阻止巨噬细胞和中性粒细胞在胰腺肿瘤中的浸润。然而，GNE-495无法增加细胞毒性T细胞的数量。因此，我们假设如果能够设计一种策略同时靶向胰腺肿瘤细胞并增加肿瘤浸润的细胞毒性T细胞数量，那么这种策略可能更有效地减轻肿瘤负担并延长动物寿命。实际上，用MAP4K4抑制剂（GNE-495）与T细胞激活受体4-1BB（CD137）的激动型抗体联合治疗KPC小鼠后，肿瘤负担减轻，动物存活期延长，胰腺肿瘤内的癌变数量显著减少。

人类胰腺肿瘤样本、细胞系、试剂和抗体

匹配的正常邻近组织（NAT）和胰腺肿瘤微阵列（TMA）从US BioLab（马里兰州罗克维尔）获取。小鼠PDAC细胞系KC-6141由我们的合作者Paul Grippo（芝加哥UIC）提供。KC-6141细胞在添加了10%胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺和100单位/ml青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养。HEK-293-FT细胞系（Thermo Fisher）在添加了10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中培养。

MAP4K4在胰腺肿瘤和肿瘤浸润巨噬细胞中过表达

人类PDAC患者中MAP4K4的表达上调与较差的预后相关[17]。为了了解MAP4K4表达在PDAC中的临床意义，我们使用GEPIA2平台分析了TCGA胰腺数据集[28]。计算机模拟分析显示，胰腺肿瘤中MAP4K4基因的高表达与胰腺癌患者的死亡率呈正相关（图1A和补充图1A）。炎症免疫反应是发展的重要风险因素

讨论

胰腺癌的5年生存率低于13%，是最致命的恶性肿瘤之一[3]。迄今为止，没有任何治疗方法能够在长期内有效治疗胰腺癌患者[42]。胰腺癌治疗失败的原因是多方面的，包括疾病诊断较晚和存在免疫抑制性的TME。胰腺肿瘤被认为是免疫学上“冷”的，因此免疫细胞介导的抗肿瘤反应效果有限

CRediT作者贡献声明

Sowdhamini Mahendiran： 方法学、数据分析。 Niraj Nag： 方法学、数据分析。 Piush Srivastava： 方法学、数据分析。 Rakesh Sathish Nair： 方法学、数据分析。 Jose Trevino： 文章撰写 – 审稿与编辑。 Ajay Rana： 文章撰写 – 初稿撰写、可视化、验证、项目监督、资金获取、数据分析、概念构思。 Periannan Sethupathi： 方法学。 Basabi Rana： 文章撰写 – 审稿与编辑、资金支持

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作者声明没有已知的财务利益冲突。

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我们感谢外科系主任Enrico Benedetti博士提供部门资源和资金支持。同时感谢退伍军人事务部的Merit Award（BX004903）和Career Scientist Award（BX004855）对Ajay Rana的支持。也感谢外科系对Basabi Rana的资金支持。本文内容仅代表作者的观点，不代表任何其他机构的立场

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或可能影响本文工作的个人关系。