胍基化壳聚糖的生物界面特性：乙酰化程度、胍基化程度及分子量的影响

《Carbohydrate Polymers》：Bio-interface properties of guanidinylated chitosans: Effects of degree of acetylation, degree of guanidinylation, and molecular weight

壳聚糖衍生物的脱乙酰度（DA）、瓜基化程度（DG）及分子量对溶解性、抗菌活性和细胞毒性的影响。研究发现DA控制在32-37%时GCS溶解性最佳，DG提升中性条件抗菌活性，低分子量GCS具有显著抑制细胞增殖能力。

　　

荒木美穂 | 松本真 | 黑田康平 | 泉澤宏典

日本宫崎大学工学研究科，宫崎市学园木花台西1-1，889-2192

摘要

我们之前报道了一种低分子量的水溶性胍基化壳聚糖（GCS），其乙酰化程度（DA）可控。然而，尽管具有不同参数的水溶性GCS有助于新型生物材料的开发，但DA、胍基化程度（DG）和分子量对GCS的溶解性、功能及生物相容性的影响仍不明确。本文研究了乙酰化壳聚糖（CS）和具有系统变化DA、DG及分子量的GCS的生物界面特性，包括其溶解性、抗菌活性和细胞毒性。溶解性测试表明，胍基化通常会降低溶解性，尤其是在DA不受控制且分子量较高的样品中；而DA值为32–37%的GCS则表现出改善的溶解性。换句话说，我们发现控制DA是提高GCS溶解性的关键因素。针对大肠杆菌（Escherichia coli）和表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）的最低抑菌浓度测定显示，降低乙酰含量比正电荷对抗菌活性更为关键，并且胍基化在中性条件下能诱导抗菌活性。细胞毒性和细胞增殖结果表明，水溶性GCS的细胞毒性较低，与乙酰化CS相当，同时能强烈抑制细胞增殖，这支持了它们作为抗癌剂的潜力。

引言

壳聚糖（CS）是一种由壳聚糖脱乙酰化得到的氨基多糖，存在于甲壳类动物外壳、鱿鱼笔、昆虫外骨骼和蘑菇中（Gal, Rahmaninia, & Hubbe, 2023）。由于其优异的生物相容性和生物降解性，CS成为开发药物输送系统和生物医学应用的潜在材料（Kumar, Muzzarelli, Muzzarelli, Sashiwa, & Domb, 2004; Ngo et al., 2015）。CS主要由通过β-1,4-糖苷键连接的D-葡萄糖胺组成；然而，其结构中也含有约5–20%的N-乙酰-D-葡萄糖胺单元。乙酰基的数量以乙酰化程度（DA）或脱乙酰化程度表示，这是控制溶解性和功能特性的重要参数（Blagodatskikh, Kulikov, Vyshivannaya, Bezrodnykh, & Tikhonov, 2017; Chatelet, Damour, & Domard, 2001; Lim, Hwang, & Lee, 2021; Younes, Sellimi, Rinaudo, Jellouli, & Nasri, 2014）。例如，由于广泛的氢键作用，CS在中性或碱性水溶液中不溶解，但在酸性条件下可溶解。这种行为归因于其氨基的pKa值（铵形式：-NH₃⁺）约为6.5，使得CS在酸性环境中带正电荷（Yadav, Kaushik, Rao, Srivastava, & Vaya, 2023）。然而，当乙酰基随机分布约50%时，CS在中性水介质中可溶解，并被广泛认为是水溶性CS（Kubota & Eguchi, 1997）。这种水溶性是由于随机分布的乙酰基导致结构不均匀，从而阻碍了结晶结构的形成（Cho, Jang, Park, & Ko, 2000）。此外，依赖于氨基正电荷的功能特性（如抗菌活性）会随着DA的增加而降低，因为氨基的数量减少（Blagodatskikh et al., 2017; Omura et al., 2003; Younes et al., 2014）。

最近，由于在中性介质中应用CS的需求增加，具有改进水溶性的CS衍生物受到了广泛关注，并已应用于多种领域（Edo et al., 2025; Suryani et al., 2024; Yuan, Tan, Zhang, Li, & Guo, 2022）。此前，我们报道了一种水溶性胍基化CS（GCS），其DA为31%，胍基化程度（DG）为48%，分子量为1.1×10⁴（Izawa, Yagi, Umemoto, & Ifuku, 2023）。与CS相比，这种水溶性GCS的蛋白质结合能力提高了约10倍，细胞内化能力提高了约2倍，这归因于强碱性的胍基的存在（Mogaki, Hashim, Okuro, & Aida, 2017）。此外，我们之前还发现，在没有DA控制的情况下，GCS不仅不溶于中性水溶液，也不溶于醋酸水溶液。因此，尽管已经证明了DA的重要性，但水溶性GCS的分子量较低，目前尚不清楚在DA控制下，更高分子量的GCS是否具有类似的效果。此外，DG对GCS溶解性的影响也不清楚。我们预期，阐明DA、DG和分子量对溶解性、功能及生物相容性的影响，并开发不同分子量的水溶性GCS，将有助于创造多种高性能的基于GCS的材料。由于CS在酸性条件下的溶解性和功能特性受限，这些材料无法通过CS实现。

在本研究中，系统合成了具有不同DA、DG和分子量的乙酰化CS和GCS，并评估了它们的水溶性（图1）。此外，还研究了水溶性CS和GCS对大肠杆菌（Escherichia coli）和表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）的抗菌活性，以说明GCS的阳离子特性所赋予的功能。为了初步评估水溶性GCS的生物相容性，还使用乳酸脱氢酶（LDH）和3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑溴化物（MTT）实验对其细胞毒性进行了评估。

材料

CS寡聚物、低粘度CS（L-CS）、中等粘度CS（M-CS）和高粘度CS（H-CS）从Koyo Chemical Co., Ltd.（日本鸟取县）购买。M_w和M_w/M_n值通过GPC在40°C的醋酸缓冲液洗脱剂中测定：Asahipak GS-220 HQ、Asahipak GS-320 HQ、Asahipak GS-520 HQ（或H-CS的Asahipak GS-620 HQ）和Asahipak GS-2G 7B（Shodex，日本）；使用L-2130泵和L-2490 RI检测器（Hitachi，日本）。流速为0.5 mL/min。

CS、乙酰化CS和GCS的溶解性

为了阐明DA、DG和分子量对溶解性的影响，合成了28种乙酰化CS和GCS样品。通常，在制备DA约为50%的水溶性CS时，需要随机分布的乙酰基（Cho et al., 2000）。因此，传统的脱乙酰化过程在异质系统中无法获得水溶性CS，因为该过程会导致乙酰基分布不均。相比之下，乙酰化CS具有随机分布的乙酰基

结论

本研究合成了具有系统变化DA、DG和分子量的GCS，以阐明其生物界面特性，包括溶解性、抗菌活性和细胞毒性。溶解性测试表明，胍基化通常会降低溶解性，尤其是在DA不受控制且分子量较高的样品中。然而，DA值为32–37%的GCS与相同DA的乙酰化CS相比表现出改善的溶解性。

作者贡献声明

荒木美穂：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、研究、数据分析、概念化。松本真：撰写 – 审稿与编辑、监督。黑田康平：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、项目管理、研究、数据分析、资源管理。泉澤宏典：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、监督、资源管理、项目管理、方法论、研究、资金支持

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本文基于一个项目（JPNP20004）的结果，该项目得到了新能源和工业技术发展组织（NEDO）的资助。