两栖动物是陆地和水生生态系统的重要组成部分。然而，全球范围内各种地理区域的这一类群的数量和生物多样性都在以前所未有的速度下降[3, 6, 14, 23, 22, 25, 36, 53]。导致灭绝的原因包括人类活动的影响、适合两栖动物的生物栖息地减少、栖息地破碎化、气候变化、流行病等因素[44, 45, 58]。这些负面因素使得保护两栖动物的种群、物种和遗传多样性的方法变得极为重要。
根据《两栖动物保护行动计划》，建立基因组资源库是制定两栖动物保护策略的重要环节[14]。基于种质冷冻保存技术的基因组资源库能够长期储存可存活的种质样本，减少对饲养场和动物园的依赖，同时避免近亲繁殖的风险，并显著促进不同饲养场之间的遗传物质交换[1, 31, 35, 56]。
目前，针对两栖动物雌性配子和胚胎的深度冷冻技术仍处于早期发展阶段[7, 16]。因此，目前只能通过冷冻保存雄性配子（即精子）来建立遗传资源库。
精子冷冻保存技术广泛应用于畜牧业、家禽养殖、水产养殖和宠物繁殖[9, 26, 38, 49, 57]，也在医学上用于解决人类不孕问题[43]。自20世纪90年代以来，精子冷冻保存技术也被用于野生动物生物多样性的保护[13, 38, 58]。早期在无尾目（Anura）动物精子冷冻保存方面的成功案例主要来自从睾丸组织中提取的精子，例如甘蔗蟾蜍（Rhinella marina）[4]以及Rana和Xenopus属的青蛙[2, 28, 37, 42, 48, 50]。然而，这种方法需要对供体实施安乐死。一种非致命的替代方法是使用激素诱导产生的精液尿液[8, 15, 30, 33]，这种方法已在某些蛙类中成功应用，如北方豹蛙（Rana pipiens）[21]、普通青蛙[52]和池塘蛙（Pelophylax lessonae）[55]。但对于蟾蜍科（Bufonidae）动物来说，这种方法尤其具有挑战性。Fowler's蟾蜍（Anaxyrus fowleri）和波多黎各冠蟾蜍（Peltophryne lemur）的冷冻精液尿液受精率较低（4-19%[10, 11, 46]），与同一科中睾丸精子的较高受精率（23-81%[4, 47]）形成鲜明对比。我们在普通蟾蜍（Bufo bufo中也观察到了类似现象：冷冻-解冻后的精液尿液受精率低于1%（未发表数据），而睾丸精子的受精率为40%[29]。
有两种可能的解释：1) 精液尿液中的精子由于精子产生后的生理变化而具有较低的冷冻耐受性[5, 31, 32]；2) 精液尿液中的初始精子浓度较低[27, 54]。事实上，标准的两栖动物精子冷冻保存方案需要对其进行大量稀释（8-12倍），这可能导致精子浓度低于成功受精所需的临界值。
我们之前的研究[51]表明，睾丸精子与精液尿液中的精子在冷冻耐受性方面没有显著差异，从而反驳了第一种假设。这表明精液尿液中精子浓度较低是主要问题。
为了解决这个问题，我们建议通过离心来提高精子浓度。然而，离心是一种较为激烈的处理方法；离心过程中的机械作用以及精子在底部的压缩可能会降低精子质量[39, 48]。因此，需要进一步研究离心对蟾蜍精子的影响，并确定最佳的离心方案。
此外，关于蟾蜍精液尿液的最佳冷冻保存方案仍不明确，不同研究在睾丸精子[4]和精液尿液[10, 11, 12]的冷却速率上存在争议。
本研究的目标是：1) 评估普通蟾蜍精子在有缓冲和无缓冲条件下离心处理的耐受性；2) 研究不同的冷冻和解冻速率对冷冻精液尿液质量的影响，以制定优化方案；3) 评估采用离心步骤冷冻保存的普通蟾蜍精子的质量和受精能力。
