《Developmental Biology》：In vitro plasticity between ureteric epithelial and distal nephron identity and maturity is controlled by extracellular signals.
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本研究针对人类多能干细胞(hPSC)来源的远端肾单位上皮在体外展现出输尿管上皮表型这一非胚胎发生现象，通过使用RETtdTomato和GATA3mCherry报告细胞系，揭示了微环境信号在决定肾上皮细胞身份中的关键作用。研究人员发现，诱导形成的前期中胚层(iND)具有可塑性，能在RSPO1作用下模式化为远端肾单位(iDN)，或在特定条件下重编程为输尿管上皮(iUE)。这项工作为构建功能性肾组织、模拟肾脏发育及疾病提供了重要模型。
想象一下，我们的肾脏内部有一个精巧的“管道系统”，它由负责收集尿液的集合管（源自输尿管上皮，UE）和负责重吸收的远端肾小管（属于远端肾单位，DN）等部分组成。在胚胎发育过程中，这两条“管线”有着截然不同的起源和清晰的界限，就像城市里的自来水管和排水管，虽然都是水管，但来源和功能各不相同。然而，科学家们在实验室里用人类多能干细胞(hPSC)培育肾脏组织时，却观察到一个奇怪的现象：本应发育成远端肾单位的上皮细胞，在某些条件下竟然可以“变身”，展现出输尿管上皮的特性。这种“身份转换”在胚胎发育的自然过程中是不会发生的。这扇在体外被意外打开的“可塑性之门”，究竟是干细胞技术在模拟胚胎发育时出现的偏差，还是揭示了肾上皮细胞命运决定的深层秘密？一个由Melissa H. Little教授领导的研究团队，在《Developmental Biology》上发表的研究，为我们解开了这一谜团。
为了探究这种可塑性背后的机制，研究人员采用了几个关键技术方法：首先，他们利用携带RETtdTomato和GATA3mCherry基因的报告干细胞系进行定向分化，以追踪关键标志物的表达；其次，他们通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术，对分化过程中形成的细胞群体进行了精细的转录组分析，以确定其身份；第三，他们运用了器官体外共培养技术，将人源诱导的肾上皮与小鼠胚胎肾脏组织共同培养，观察其在体内微环境中的行为转变；最后，他们进行了离体重组实验和三维基质胶(Matrigel)单细胞培养，以验证单个上皮祖细胞的克隆形成能力及其命运选择。
Patterning to a GATA3+RET+epithelium
研究人员首先模拟了胚胎中肾导管(ND)的起源条件，对hPSC进行短暂的低剂量GSK-3抑制剂CHIR99021处理，诱导其分化为前期间中胚层(AIM)。在随后的培养中，使用包含FGF9、GDNF、视黄酸等因子的培养基，成功诱导出自发形成的、表达PAX2、LHX1、GATA3和RET等ND/UE标志物的上皮网络。流式细胞术和qPCR分析证实了这些细胞群体高度富集了ND相关基因。
Single cell profiling identifies an induced nephric duct-like epithelial population
为了精确鉴定这些诱导上皮的身份，研究者对第14天的类器官进行了单细胞转录组分析。分析显示，形成了一个占主导地位的上皮细胞簇（簇0），其表达ND标志物(如PAX2/8、GATA3、LHX1)和UE相关基因(如HNF1B、EMX2、KRT8)。然而，该上皮也表达远端肾单位的标志物，且未观察到典型的输尿管分支形态。因此，研究者将这种初始诱导的上皮定义为“诱导肾导管样”(iND)群体，其身份处于一种未确定状态，兼具ND、UE和远端肾单位的特征。
RSPO1 mediates the effect of WNT signalling supporting distalized epithelial patterning
鉴于LGR4和LGR5在iND的不同亚群中差异表达，研究者测试了Wnt信号增强剂RSPO1的作用。结果发现，加入RSPO1后，GATA3mCherry阳性的上皮细胞重组成相互连接的网状结构，并呈现出明确的远端肾单位模式化特征。免疫荧光染色显示，出现了表达SLC12A3+mCherry+的远端小管(DCT)和SLC12A1+mCherry-的亨利氏环厚壁段(TAL)区域，但未发现近端小管或肾小球。这表明RSPO1引导iND向成熟的远端肾单位(iDN)命运转变，形成了“远端化”的肾脏类器官。
Transcriptional evidence of distal nephron fate in response to extended RSPO1
进一步的单细胞转录组分析证实，经RSPO1处理的类器官中，绝大多数上皮细胞获得了远端肾单位身份，表达了GATA3、IRX1、FXYD2、SLC12A1等标志基因，而未见肾小球或近端肾单位特征。通过与已发表的hPSC来源UE数据集对比，并利用肾脏细胞分类工具DevKidCC进行分析，结果显示本研究中的上皮群体被鉴定为早期远端肾单位，而非UE，再次确认了RSPO1诱导的远端化效应。
Distalized organoid epithelium adopts a ureteric epithelial identity within mouse embryonic kidney
尽管转录组分析显示为远端肾单位身份，但研究者测试了这些细胞的潜力。他们将从远端化类器官中分选出的mCherry+上皮细胞，与解离的小鼠胚胎肾脏细胞进行重组培养。令人惊讶的是，这些人源细胞成功地整合到了小鼠的输尿管上皮(UE)结构中，甚至形成了分支状的上皮网络。这证明，在胚胎肾脏的微环境中，iDN上皮可以被“重编程”，获得输尿管上皮(iUE)的身份。
Epithelial plasticity in response to surrounding embryonic stroma
为了更精确地探究微环境信号的作用，研究者进行了原位移植实验。他们将手工解剖的mCherry+上皮组织块，分别移植到小鼠胚胎肾脏的生肾区、输尿管周围间质或受损的输尿管树旁边。结果发现，移植物的命运完全由周围组织决定：在生肾区旁，它吸引了Six2+的帽间充质细胞，表现出输尿管尖端的特性；在输尿管周围间质中，它表达尿路上皮蛋白UPK3A并被平滑肌肌动蛋白包绕，呈现肾导管样表型；当连接受损的输尿管树时，它能与宿主UE融合并形成连续结构。
Formation and maturation of ureteric epithelium from single epithelial progenitors supports plasticity of cellular identity
最后，研究者证明了这种可塑性的细胞自主性。他们将单个分选的mCherry+细胞接种于基质胶中培养。这些单细胞能够存活、增殖并形成上皮球体。这些球体高表达RET、GFRα1、ETV5等输尿管尖端标志物，并具有上皮管腔和顶-基底极性。这表明，远端化类器官中的单个上皮祖细胞，在脱离原有基质、仅提供合适生长因子的体外三维环境中，能够自主地发育为具有iUE特征的细胞结构。+上皮祖细胞能在基质胶中形成表达输尿管上皮标志物的上皮球体，证实了其可塑性。">
本研究得出结论：通过定向分化hPSC获得的前期中胚层来源的肾上皮，在体外展现出了在肾导管样(iND)、远端肾单位(iDN)和输尿管上皮(iUE)之间连续转换的惊人可塑性。这种细胞命运的转变并非预先注定，而是由细胞外微环境信号精确调控的。RSPO1介导的Wnt信号通路促进其向远端肾单位分化，而胚胎肾脏间质或特定的三维细胞外基质则能驱动其重编程为输尿管上皮。
这项研究的意义重大。首先，它挑战了传统上认为肾单位（远端）和集合管系统（输尿管来源）在发育起源上严格区分的观念，揭示了二者在分子水平和发育潜能上存在深刻的联系和连续性。其次，它强调了微环境（包括生长因子、细胞外基质和相邻细胞）在决定和维持肾上皮细胞身份中的核心作用。这为理解肾脏发育、再生以及疾病状态下细胞身份的异常转换提供了新视角。最后，从应用角度看，该研究建立了一个强大的体外模型系统。通过操控特定的信号通路（如RSPO1）或微环境，研究者可以相对可控地生成特定类型的肾上皮细胞（如DCT、TAL或UE），这为精准模拟各种远端肾小管疾病（如Gitelman综合征、Bartter综合征）或集合管/尿路疾病（如常染色体隐性多囊肾病）提供了潜在的细胞来源，推动了肾脏疾病建模和再生医学的发展。
