《Environment International》：Capture sequencing demonstrates promising public health potential for post-COVID wastewater surveillance: a comparative multi-technique and spatiotemporal analysis
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为应对后新冠时代常规分子检测技术（如RT-qPCR和tNGS）在病原体全面监测上的局限性，本研究首次在中国大规模应用杂交捕获测序（HybCapSeq）进行废水监测。研究评估了包括三种商业和两种定制探针面板在内的五套探针在废水病原体（如SARS-CoV-2）检测中的性能与单样本成本，并将其与RT-qPCR和tNGS进行了对比。研究团队在中国两个城市的七类采样点进行了纵向监测，发现基于捕获测序获得的SARS-CoV-2基因组覆盖度变化趋势领先临床报告病例趋势1-2周，显示出作为废水监测早期预警指标的潜力。此外，该技术还能同时检测多种人类致病病毒、识别新型病毒类群，并展现了对细菌和抗生素抗性基因进行监测的潜力。该工作为将HybCapSeq整合进废水流行病学框架，实现全面、可扩展且经济有效的公共卫生监测提供了证据支持。
在经历了新冠大流行后，全球对病原体的早期预警和持续监测能力提出了更高要求。废水，作为一种汇集了人类排泄物、环境微生物等多种信息的复杂“信息库”，为无创、大范围的公共卫生监测提供了独特窗口。基于废水的流行病学监测（Wastewater-Based Epidemiology, WBE）在新冠疫情期间被证明是追踪SARS-CoV-2的有效工具。然而，进入后新冠时代，公共卫生的威胁并未消失，流感、诺如病毒等呼吸道和肠道病毒仍在持续传播，新型病原体也可能随时出现。传统的监测“工具箱”主要依赖逆转录定量PCR（RT-qPCR）和靶向扩增子测序（tNGS）。前者虽然灵敏快速，但一次只能针对特定病原体，缺乏广度；后者能进行基因组分析，但其靶向能力也有限。而无偏倚的宏转录组测序虽能“广撒网”，却在废水复杂背景噪音中难以钓到“大鱼”——目标病原体的信号常常被淹没。有没有一种方法既能像PCR一样灵敏地“锁定”目标，又能像测序一样“眼观六路，耳听八方”，同时对众多已知乃至未知的病原体进行“扫描”呢？来自中山大学等机构的研究团队将目光投向了杂交捕获测序技术，并将这项技术系统性地应用于中国的城市废水监测，旨在评估其在后新冠时代作为综合性、经济高效的公共卫生监测平台的潜力。该研究近期发表于《Environment International》。
本研究的主要关键技术方法包括：1）样本队列与收集：研究团队从2024年1月至2025年2月期间，在中国南宁市的三座污水处理厂和广州市的一个污水处理厂及六个哨点（涵盖社区、医院、学校、市场、商业中心和交通枢纽），每周或每两周收集一次废水复合样本，共分析了343份样本进行大规模测序，另有21份试点样本用于方法比较。2）多技术平台比较：对样本平行采用RT-qPCR、tNGS、宏转录组测序以及杂交捕获测序进行处理与分析。3）杂交捕获测序工作流：研究使用了五套探针面板进行性能与成本评估，并最终选取性能最优的商业面板用于大规模监测。4）生物信息学分析：使用Freyja等工具进行病毒谱系分析，使用EsViritu和VirID流程进行病毒检测与潜在新病毒鉴定，并使用IDseq流程分析细菌群落和抗生素抗性基因。
1. 杂交捕获测序为废水中SARS-CoV-2监测提供了可靠工具
研究人员首先在长达一年的纵向监测中比较了各种方法在追踪SARS-CoV-2方面的表现。他们发现，基于捕获测序的两种指标——病毒相对丰度和基因组覆盖度——与每周报告的临床新冠病例数高度相关，且相关性略高于RT-qPCR测得的病毒浓度。更关键的是，在南宁江南区和高新区，基因组覆盖度的变化趋势比临床病例报告趋势提前了1至2周，显示出其作为疫情早期预警信号的潜力。此外，通过与RT-qPCR结果对比，捕获测序在343份废水样本中展现出78.3%的灵敏度和95.9%的特异性，证实了其监测的可靠性。在变异株追踪方面，捕获测序在病毒载量较高的样本中，其检测到的主要变异株群与tNGS结果高度一致。
2. 杂交捕获测序增强了多病原体同步监测能力
与未富集的宏转录组测序相比，捕获测序将废水中的病毒序列富集了2-3个数量级，并显著提升了可检测的脊椎动物病毒种类数量。在整个监测期内，捕获测序共检测到32个病毒科、92个属、246个物种及560个毒株，其中轮状病毒、诺如病毒、星状病毒等肠道病毒最为常见。通过验证性RT-qPCR对其中五种病毒进行定量分析，发现捕获测序的检测信号与病毒基因组拷贝数呈高度正相关，证实了其定量监测的准确性。研究还发现，超过70%被检测到的病毒基因组或片段获得了超过50%的覆盖度，为定量分析和基因组表征提供了足够深度。
3. 杂交捕获测序揭示了病毒组的时空动态
分析显示，病毒群落结构在时间和空间上呈现出显著差异。通过t-SNE降维分析，样本的病毒群落组成能够根据采集城市和日期进行明显区分。南宁的样本显示出比广州哨点更高的病毒检出多样性。此外，病毒群落会随时间推移而逐渐分化，且在不同采样点类型间也存在显著差异。研究人员发现，病毒群落的α多样性（香农指数）随着服务人口规模（从1万到10万）的增加而增加，之后趋于稳定。
4. 探索杂交捕获测序在监测细菌和抗生素抗性基因方面的潜力
尽管使用的捕获面板主要针对病毒设计，测序数据中高达95.05%的读长属于细菌序列，这揭示了废水样本中丰富的细菌群落信息。通过与宏转录组测序对比，两者检测到的细菌群落结构高度相似。在所有采样点和时间段，均检测到多种与人类相关或具有潜在致病性的细菌属/种。同时，研究还检出了多种抗生素抗性基因（ARGs），如tet(C)、APH(3‘)-Ia、TEM-1等，其抗性类别主要为四环素、氨基糖苷类和单环内酰胺类抗生素。ARGs的丰度和多样性与细菌群落结构显著相关，并且在不同的采样点（尤其是医院哨点）展现出独特的分布模式。
研究结论与重要意义
该研究是首次在中国大规模应用杂交捕获测序进行废水监测的纵向研究。研究结果表明，杂交捕获测序（HybCapSeq）是一种强大、可靠且具有前瞻性的废水监测平台。其优势主要体现在以下几个方面：
- 1.
全面的多病原体监测：相比于传统方法，HybCapSeq能够在一次实验中同时、灵敏地监测SARS-CoV-2、多种呼吸道与肠道病毒，甚至潜在的新型病毒，实现了从“点”到“面”的监测能力飞跃。
- 2.
潜在的早期预警价值：研究观察到，在某些情况下，基于捕获测序的病毒基因组覆盖度变化趋势能够领先于临床报告趋势1-2周，为疫情早期预警提供了新的可能性。
- 3.
经济高效的策略：研究通过比较不同的探针面板，探索了在保证性能的同时降低成本的优化路径。定制化设计的探针面板（如AJTK-Custom_v2）在改善富集效率的同时降低了单样本成本，为未来的大规模应用提供了更具可行性的选择。
- 4.
扩展的应用前景：即使使用病毒富集面板，研究也从数据中成功解析了细菌群落结构和抗生素抗性基因谱，这证明了HybCapSeq技术在监测细菌性病原体和抗生素耐药性方面的巨大潜力。未来可通过设计包含细菌和ARG靶点的探针进一步扩展其应用范围。
总之，该研究强调了将HybCapSeq与现有RT-qPCR、tNGS等工作流程整合，可以形成一个成本效益高、分辨率高的综合性病原体筛查策略。这不仅有助于加强疫情防范和应对能力，也为建立一个覆盖病原体、环境污染物及抗生素耐药性的自动化、全球化监测预警体系描绘了蓝图。正如论文所展望的，这种综合性的端到端系统有望成为应对未来公共卫生危机的“第一道防线”。
