在Penaeus vannamei（越南对虾）中，caspase Dronc（Pvcaspase Dronc）调控了对Vibrio alginolyticus感染的凋亡清除过程

《Fish & Shellfish Immunology》：The caspase Dronc in Penaeus vannamei ( Pvcaspase Dronc) orchestrates apoptotic clearance of Vibrio alginolyticus infection

对虾Pv caspase Dronc基因的克隆、定位及抗菌功能研究。通过差异表达基因分析克隆了Pv caspase Dronc全长cDNA（908bp编码266aa），含保守的caspase招募域，与果蝇Dronc同源性81%。亚细胞定位显示其在S2细胞呈 punctate分布。组织分布显示主要表达于眼柄和肝胰腺，Vibrio alginolyticus感染后显著上调肝胰腺、血细胞等组织表达。dsRNA沉默实验证实Pv caspase Dronc对抑制细菌定植、维持血细胞存活率及凋亡调控至关重要。

　　

李海西|刘正新|陈翠菊|梁振华|龙浩|张鑫|谢振宇

海南省热带水生生物学与生物技术重点实验室，海南大学海洋生物与渔业学院，海口市，海南570228，中国

摘要

Pv半胱天冬酶Dronc是从Penaeus vannamei肝胰腺组织在感染Vibrio alginolyticus前后的差异表达基因中鉴定并克隆出来的。Pv半胱天冬酶Dronc的全长cDNA包含908个碱基对，编码266个氨基酸。保守结构域分析显示Pv半胱天冬酶Dronc含有一个半胱天冬酶招募结构域。多物种氨基酸比对显示Pv半胱天冬酶Dronc与Drosophila melanogaster的Dronc（NP_524017.1）有81%的相似性。系统发育树结果表明Pv半胱天冬酶Dronc与哺乳动物半胱天冬酶-9关系最为密切。亚细胞定位分析显示Pv半胱天冬酶Dronc在S2细胞中呈点状均匀分布。Pv半胱天冬酶Dronc在Penaeus vannamei的12种组织中均有广泛分布，其中在眼柄和肝胰腺中的表达水平最高。Vibrio alginolyticus感染显著上调了Pv半胱天冬酶Dronc在肝胰腺、血细胞和肠道中的表达。通过dsRNA成功沉默了Pv半胱天冬酶Dronc，在注射后24小时和48小时，血细胞、鳃和肝胰腺中的沉默效果均显著。在虾中降低Pv半胱天冬酶Dronc的表达后，Vibrio alginolyticus感染导致细菌菌落数量增加和存活率下降，表明其抗菌防御能力受损。通过流式细胞术分析，在Vibrio alginolyticus感染后0-24小时内，Pv半胱天冬酶Dronc沉默的虾的血细胞凋亡率显著降低。本研究通过体内和体外沉默或过表达实验研究了Pv半胱天冬酶Dronc的分子特性和抗菌功能，为了解虾的免疫防御机制提供了初步见解，并初步了解了虾对Vibrio alginolyticus的反应。

引言

Penaeus vannamei是中国水产养殖中最具有经济价值的虾类之一[1]。然而，在高密度集约化养殖条件下，由Vibrio alginolyticus等致病弧菌引起的疾病频繁发生[2]。在患病的虾的肝胰腺和肠道中通常检测到大量V. alginolyticus[3],[4]，疾病爆发导致严重的经济损失[5],[6],[7]。证据表明，V. alginolyticus感染会导致虾死亡、肝胰腺损伤、免疫酶活性失调、肠道损伤、肠道微生物群失衡、代谢紊乱、血细胞数量减少、血细胞凋亡率增加以及免疫力下降[8],[9],[10]。因此，研究虾抵抗病原体入侵的防御机制是一个重要的研究课题。

凋亡是一种由半胱天冬酶介导的进化保守的程序性细胞死亡机制，在动物发育、维持细胞稳态和免疫调节中起着关键作用。它在后生动物中不可或缺[11],[12],[13]，并且从果蝇到人类都存在进化保守性[14],[15]。凋亡不仅能够有效清除受损或不需要的细胞，还有助于维持正常的免疫防御功能，并且在病原体感染期间经常被诱导[16]。凋亡细胞通过招募吞噬细胞来促进受感染宿主细胞的清除，防止病原体的进一步传播[17],[18]。凋亡依赖于半胱天冬酶，后者是细胞死亡、发育、先天免疫和宿主防御的关键调节因子，可以通过外在或内在途径被激活[19],[20]。凋亡的启动涉及启动半胱天冬酶和效应半胱天冬酶的蛋白酶级联反应[21]。细胞死亡和炎症机制的完整性不仅对成功的胚胎发育和组织稳态至关重要，还参与抵抗病原体的免疫反应，进化保守的半胱天冬酶家族在其中起着核心作用[22]。

半胱天冬酶-9在内在凋亡途径中起核心作用，能响应多种凋亡刺激[23]。在哺乳动物中，启动半胱天冬酶-9由凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）激活。Apaf-1-半胱天冬酶-9复合物形成凋亡小体，这是多细胞生物中细胞死亡的一个保守平台。半胱天冬酶-9前体浓度的局部增加会触发其自身激活，进而激活下游的效应半胱天冬酶[21]。从半胱天冬酶-9缺陷小鼠中分离出的细胞对各种促凋亡刺激（包括毒素、应激诱导因子、药物和辐射）表现出抗性[24]。半胱天冬酶-9在需要清除的细胞中启动凋亡执行阶段非常重要，对于多细胞生物在其生命周期中持续清除受损细胞以抑制疾病至关重要[25]。Apaf-1和半胱天冬酶-9的同源物在所有多细胞动物中都存在。Drosophila melanogaster的Apaf-1同源物DARK也会聚集成八聚体凋亡小体，激活其启动半胱天冬酶Dronc[26]。

死亡调节因子Nedd2样半胱天冬酶（Dronc）是Drosophila melanogaster中的一种促进半胱天冬酶，含有半胱天冬酶招募结构域（CARD）[27]。Dronc具有进化保守性，与哺乳动物半胱天冬酶-9具有同源性。它参与调节细胞死亡和炎症免疫反应，调节组织特异性免疫信号传导和宿主-微生物群相互作用[13],[22]。在非凋亡条件下，Dronc受到Drosophila凋亡抑制剂Diap-1介导的泛素化的抑制。然而，在促进凋亡的条件下，Diap-1被促凋亡蛋白Reaper、Hid和Grim拮抗。通过相应的宿主半胱天冬酶招募结构域（CARD）之间的相互作用，与哺乳动物Apaf-1同源的Dark蛋白促使Dronc响应，从而激活凋亡小体[21]。凋亡过程由半胱天冬酶启动，并需要形成凋亡小体复合物。当Dronc从Drosophila凋亡抑制剂Diap-1的抑制中释放出来后，它会与Drosophila的Apaf-1相关基因相互作用，成为凋亡小体的一部分。该凋亡小体会切割并激活半胱天冬酶Dcp-1和Drice，最终诱导细胞死亡[21]。

在病原体感染期间，凋亡可以被启动以清除受损或受感染的细胞，从而抑制病原体的传播并增强宿主的抗菌免疫力[28]。在Drosophila中，病原体感染后Diap-1水平降低会激活Dronc，触发细胞凋亡[16]。凋亡细胞通过招募吞噬细胞来促进受感染宿主细胞的清除，从而防止病原体的进一步传播[17],[18]。这种对凋亡细胞的吞噬作用有助于甲壳类动物和哺乳动物清除病原体。像Drosophila和虾这样的无脊椎动物缺乏适应性免疫系统。当暴露于外源性刺激或健康威胁时，血细胞数量会急剧下降。迅速恢复血细胞数量并执行凋亡、吞噬作用和黑色素化等功能以清除外来物质至关重要[29]。在Drosophila中，Dronc调节肠道细胞的更新。上皮细胞的更新受到代谢状态和病原细菌等外部因素的影响。病原刺激可以增加半胱天冬酶的活性，导致细胞死亡并帮助机体增强抗菌免疫力[30],[31]。

目前，关于半胱天冬酶Dronc（半胱天冬酶-9）及其对病原体感染影响的研究主要集中在人类和Drosophila melanogaster上[32],[33]。研究Penaeus vannamei中的Dronc半胱天冬酶是否以及如何调节凋亡和对V. alginolyticus感染的炎症反应，可以进一步阐明虾免疫系统与V. alginolyticus之间的相互作用机制。这项研究可以为阐明虾对细菌感染的抵抗机制提供理论基础。

然而，目前的疾病控制策略主要依赖于抗生素和益生菌[34],[35]。抗生素的广泛使用导致了弧菌抗性的增加，造成了环境残留和食品安全问题[36]。同时，益生菌的效果往往受到水质和环境微生物群等因素的限制[37]。因此，研究虾抵抗V. alginolyticus感染的内源性分子机制至关重要。

在本研究中，我们鉴定并克隆了Pv半胱天冬酶Dronc。确定了Pv半胱天冬酶Dronc在S2细胞中的亚细胞定位。我们还通过体外和体内基因沉默及过表达实验研究了Pv半胱天冬酶Dronc的分子特性和抗菌功能，从而为深入理解虾免疫系统与V. alginolyticus之间的相互作用奠定了理论基础。

部分内容摘录

动物和弧菌

健康的虾平均长度为6.86 ± 0.48厘米，平均重量为3.75 ± 0.28克，来自海南文昌的一个水产养殖场。这些虾在循环海水系统（盐度25%）中适应至少一周，系统温度保持在28 ± 1°C，并持续通气，每天两次喂食商业饲料。所有动物实验均获得了海南大学动物研究与伦理委员会的许可。

关于组织分布，不同组织（心脏）...

Pv半胱天冬酶Dronc的序列分析

从V. alginolyticus感染前后虾肝胰腺的差异表达基因中，我们克隆并确认了其完整的编码序列，该序列包含一个801个碱基对的开放阅读框（ORF），编码266个氨基酸的蛋白质（图1A）。氨基酸序列分析表明Pv半胱天冬酶Dronc蛋白含有一个CASs结构域（图1B），该结构域在所有比较序列中（包括无脊椎动物和脊椎动物）都得到了很好的保守。

讨论

Dronc是Drosophila melanogaster中唯一的凋亡启动半胱天冬酶。凋亡在各种生物中都是进化保守的，用于清除异常或受损的细胞，例如被病原体感染的细胞[19],[46]。这一过程主要由半胱天冬酶介导，半胱天冬酶是一类作为凋亡核心执行者的半胱氨酸蛋白酶[20]。根据功能，半胱天冬酶被分为两类：启动半胱天冬酶和效应半胱天冬酶。

数据可用性

本文描述的研究没有使用任何数据。

作者致谢

李海西：写作-审稿与编辑、写作-初稿、可视化、软件、方法学。刘正新：方法学、数据管理、写作-审稿和编辑。陈翠菊：资源获取、验证。梁振华：数据管理。龙浩：监督、概念构思。张鑫：写作-审稿与编辑、写作-初稿、监督、资金获取、概念构思。谢振宇：监督、资金获取、概念构思。

致谢

本工作得到了中国海南省自然科学基金（325RC654）、国家自然科学基金（32560903、42206105）以及HNARS专项基金（HNARS-10-G03）的支持。