尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）中isg15基因的鉴定及其在免疫反应调节中的作用分析

《Fish & Shellfish Immunology》：Identification of an isg15 gene in Nile tilapia ( Oreochromis niloticus) and analysis of its role in immune response modulation

Isg15在尼罗 tilapia 中的抗菌功能及其对免疫应答的调控机制研究。通过鉴定 tilapia 的 Onisg15 基因，发现其具有典型 UBL 结构和 LRLRGG 等保守序列，感染 Edwardsiella piscicida 和 Streptococcus agalactiae 后显著上调表达，重组蛋白增强巨噬细胞杀菌和呼吸爆发能力，同时激活 I 型干扰素及相关促炎因子。

　　

王洋|唐文欣|吴贵春|何娇娇|顾汉杰|胡永华

中国热带农业科学院湛江实验站，湛江，524013，中国

摘要

干扰素刺激基因15（Isg15）是一种由I型干扰素（IFN）诱导的类泛素蛋白，在抗病毒先天免疫中起着关键作用；然而，其在硬骨鱼类中的抗菌功能尚不明确。在本研究中，我们从尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）中鉴定并表征了一个名为isg15的基因（Onisg15），并探讨了其在抗菌免疫反应中的调控作用。Onisg15编码一种含有两个保守的类泛素（UBL）结构域和一个典型的C端LRLRGG结合基序的156个氨基酸的蛋白质，这些是Isg15同源物的特征性结构特征。UBL结构域采用典型的β-抓握折叠和α-螺旋结构。Onisg15基因在健康罗非鱼的所有测试组织中均呈组成型表达，其中心脏中的转录水平最高。Edwardsiella piscicida和Streptococcus agalactiae感染显著诱导了头部肾脏、脾脏、肝脏和外周血液中Onisg15的表达。从Escherichia coli中表达和纯化的重组OnIsg15（rOnIsg15）显著增强了罗非鱼初级头部肾脏巨噬细胞的杀菌活性和呼吸爆发能力。此外，OnIsg15显著提高了I型干扰素（IFNc、IFNh、IFNd1、IFNd2）和促炎细胞因子（IFNγ、IL-6和IL-8）的转录水平。综合这些发现，表明OnIsg15可能通过调节巨噬细胞效应功能及促炎细胞因子的表达来参与宿主的抗菌防御。

引言

I型干扰素（IFN）信号通路是针对入侵病原体的经典细胞内先天防御机制。它能够诱导强烈的抗病毒和抗菌状态，使细胞对感染具有抵抗力。当IFN与其特异性受体结合后，与质膜相关的STAT蛋白会被JAK1和TYK2激酶磷酸化并激活。激活的STAT随后转移到细胞核中，与干扰素刺激基因（Isgs）上游的cis作用调控元件结合，从而启动Isg的转录[1]。Isg蛋白家族调节IFN信号传导，包括病毒识别因子或模式识别受体、蛋白激酶R、核糖核酸酶L、Mx1和Isg15[2]。

Isg15是一种15 kDa的线性双类泛素蛋白，其表达不仅受IFN、病毒感染和基因毒性应激的调控，还受视黄酸、双链RNA和细菌内毒素的诱导[3]、[4]、[5]。Isg15的关键结构域分别位于C端和N端，称为类泛素（UBL）结构域，它们与泛素具有显著的序列和结构同源性[6]。类似于泛素，Isg15通过异肽键与多种细胞蛋白结合，这一过程称为ISG化。这种修饰依赖于涉及E1（Ube1L）和E2（UBC8）酶的酶促级联反应，类似于泛素化机制[6]、[7]。Isg15及其结合系统在先天免疫反应中起着关键作用。在游离或结合状态下，Isg15作为细胞内类泛素分子或分泌分子发挥作用，调节干扰素信号传导、应激反应和翻译，并且也与某些癌症有关[8]、[9]、[11]。

虽然Isg15的抗病毒功能在哺乳动物和硬骨鱼类中已被充分证实，但其在抗菌免疫中的作用仍不明确。在哺乳动物系统中，Isg15的过表达可促进内质网和高尔基体蛋白的ISG化，增强对抗Listeria monocytogenes感染的细胞因子的分泌[12]。此外，细胞外的Isg15可作为细胞因子与IL-12协同作用，诱导T细胞和自然杀伤细胞产生IFNγ，从而有助于控制Mycobacterium tuberculosis[13]。在硬骨鱼类中，也有证据表明Isg15具有抗菌作用。例如，来自红鼓鱼（Sciaenops ocellatus）的重组Isg15被报道可以增强头部肾脏巨噬细胞对Listonella anguillarum的杀菌能力和酸磷酸酶活性[14]。同样，在半光滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）中，Vibrio anguillarum感染后Isg15的表达会上升[15]。尽管有这些观察结果，但鱼类Isg15介导的抗菌免疫的分子机制——特别是其对巨噬细胞效应功能和下游细胞因子网络的影响——仍不清楚。

尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）是联合国粮农组织推荐的主要水产养殖物种，也是全球第二大养殖鱼类，在集约化养殖条件下面临严重的细菌性疾病威胁[16]。特别是Edwardsiella piscicida和Streptococcus agalactiae引起的严重爆发会导致大量死亡和巨大的经济损失[17]、[18]。虽然先天免疫对罗非鱼抵御这些病原体至关重要，但Isg15的具体作用尚未明确。为了解决这一问题，我们从尼罗罗非鱼中鉴定并表征了一个Isg15同源物（OnIsg15），并研究了其在组织和细胞水平上的表达和功能。我们的结果表明，在E. piscicida和S. agalactiae感染后，Onisg15的表达会上升。此外，重组OnIsg15蛋白激活了头部肾脏巨噬细胞，并上调了I型干扰素和关键促炎细胞因子的表达。

实验部分

细菌菌株、罗非鱼和实验设计

本研究中使用的细菌菌株和质粒详见补充表S1 [19]、[20]。E. piscicida TH1和S. agalactiae HN016在Luria-Bertani（LB）琼脂（1.5% wt/vol）培养基中于28°C培养。Escherichia coli菌株Trans1-T1和BL21（DE3）在LB琼脂中于37°C培养。根据需要，向培养基中添加链霉素（Spc，100 μg/mL）、多粘菌素B（PMB，100 μg/mL）或卡那霉素（Kan，50 μg/mL）以分别选择S. agalactiae、E. piscicida或E. coli>

健康

OnIsg15的鉴定

从O. niloticusOnisg15基因，得到一个全长开放阅读框（ORF）为471 bp，编码156个氨基酸的多肽（图1A）。与其他脊椎动物的Isg15同源物类似，OnIsg15具有两个经典的UBL结构域和一个保守的C端LRLRGG基序。值得注意的是，鱼类Isg15与哺乳动物Isg15蛋白的不同之处在于LRLRGG基序下游缺乏额外的氨基酸残基（图1B）。使用NetPhos-3.1服务器进行的预测分析显示

讨论

作为首个被鉴定的类泛素蛋白[7]，Isg15是硬骨鱼类早期先天免疫反应的关键组成部分，能够抵御多种病毒[23]、[24]、[25]、[26]、[28]和细菌[14]、[15]、[29]、[30]。本研究全面分析了尼罗罗非鱼中OnIsg15的分子和功能特性，重点关注其对E. piscicida和S. agalactiae的抗菌作用。我们的结果证实了OnIsg15与其他

伦理声明

本研究中使用的标本不涉及濒危或受保护的物种，实验不需要特殊许可。所有动物实验均遵循中国热带农业科学院湛江实验站的动物研究和伦理委员会指南并获得批准（批准编号：CATAS-20240012ZES）。

作者声明

王洋：提出初步想法、项目管理、数据收集、数据分析、撰写初稿；唐文欣：项目管理、数据收集、数据分析；吴贵春：巨噬细胞提取、数据收集；何娇娇：鱼类饲养、数据收集；顾汉杰：数据整理；胡永华：资源协调、监督、审稿与编辑。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（U23A20255）、海南省“南海之星”科技创新人才平台项目（NHXXRCXM202325）、中央公益性科研机构基础研究基金（1630012025801）以及中国热带农业科学院国家热带农业科学中心科技创新团队的支持（CATASCXTD2024016）。