《International Journal of Biological Macromolecules》：The ubiquitin-like domain of TANK-binding kinase 1 mediates its binding and antagonism by snakehead vesiculovirus (SHVV) phosphoprotein to facilitate virus replication
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蛇头 vesiculovirus（SHVV）磷蛋白（P）通过其Ubiquitin-like domain（ULD）与宿主蛋白TBK1直接相互作用，抑制干扰素信号通路和抗病毒免疫应答。结构预测、分子对接及Co-IP实验证实ULD是SHVV-P与TBK1结合的关键区域，过表达TBK1增强抗病毒反应，而SHVV-P可拮抗该效应。该机制为开发靶向抗病毒策略提供了新靶点。
张书鹏|杜慧|黄俊伟|孔楚政|李森|王超|马海翔|刘涛|王高学|凌飞|王二龙
中国海南省三亚市西北农林科技大学海南研究院，572024
摘要
蛇头泡囊病毒（SHVV）是一种新出现的高致病性弹状病毒，可感染多种具有经济价值的鱼类，对水产养殖的可持续发展构成严重威胁。已知弹状病毒的磷蛋白（P）有助于病毒复制和逃避宿主免疫，但其具体机制尚不清楚。本研究通过对感染SHVV的鱼类进行脾脏转录组分析，发现了一些显著富集的信号通路；通过pull-down实验结合质谱分析，发现TANK结合激酶1（TBK1）是与SHVV-P相互作用蛋白中排名第一的。通过AlphaFold3结构预测、分子对接、共免疫沉淀（Co-IP）、圆二色光谱和荧光共定位实验进一步确认了这种直接相互作用。随后研究了TBK1在蛇头鱼中的结构特性及其对SHVV感染的响应。此外，过表达TBK1在体外和体内均能增强干扰素的产生并抑制病毒复制；相反，过表达SHVV-P会拮抗TBK1介导的抗病毒反应。最后，结构建模、共免疫沉淀和共定位实验表明，TBK1的泛素样结构域（ULD）是其与SHVV-P结合的关键部位。这些发现为理解SHVV的致病机制提供了新的见解，并为开发针对该病毒的靶向控制策略奠定了基础。
引言
弹状病毒科（Rhabdoviridae）包含包膜的单链负链RNA病毒，病毒颗粒呈子弹形或杆状，直径约为70–100纳米，长度约为100–430纳米[1]，[2]。病毒基因组通常为10至16千碱基对，3′端和5′端分别具有引导区和尾随区，按3′-N-P-M-G-L-5′的顺序编码蛋白质[3]。某些病毒成员还会表达辅助蛋白[4]，[5]。弹状病毒具有广泛的宿主范围，可感染植物和动物，包括哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类和节肢动物[6]。一些高致病性病毒会引起严重疾病[7]；例如，狂犬病毒一旦出现症状几乎100%致命[8]，而水泡性口炎病毒（VSV）尽管死亡率较低，但会导致牲畜生产损失[9]。在水产养殖中，传染性造血坏死病毒（IHNV）[10]、病毒性出血性败血症病毒（VHSV）[11]和大口黑鲈弹状病毒（MSRV）[12]等病毒可导致养殖鱼类大规模死亡，造成重大经济损失。2013年发现的高致病性蛇头泡囊病毒（SHVV）通过感染蛇头鱼和 Mandarin 鱼等关键鱼类，对水产养殖构成严重威胁[13]，[14]，[15]。该病毒会引起厌食和嗜睡等临床症状[16]，每年在中国蛇头鱼养殖业中造成超过1亿元人民币的经济损失[14]，[15]。
事实上，尽管病毒能造成严重损害，但其感染和复制过程并非易事[17]。宿主拥有强大的先天免疫系统来抵御这些入侵[18]。对于RNA病毒，宿主细胞内的模式识别受体RIG-I能够识别外源RNA并激活MAVS信号通路，从而招募TBK1并磷酸化IRF3和NF-κB，最终诱导I型干扰素（IFN）的产生和大量干扰素刺激基因（ISGs）的表达，从而清除或抑制病毒[19]，[20]。值得注意的是，最近的研究还揭示了其他模式识别受体（如Toll样受体）在抗病毒免疫中的重要作用[21]。然而，病毒进化出了多种策略来逃避宿主识别和免疫反应。其中，弹状病毒的磷蛋白由于其高度磷酸化特性和多功能性，在病毒复制和免疫调节中起着关键作用。例如，SHVV-P可以调节L蛋白的降解速率[22]，从而影响病毒复制效率；SHVV-P还能抑制hnRNPA1介导的多聚泛素化，使其能够通过蛋白酶体和溶酶体途径逃避降解[23]；此外，SHVV-P还劫持DDX3X解旋酶，破坏自噬-溶酶体降解途径，增强自身稳定性并促进病毒复制[24]。此外，P蛋白与microRNA-214（miR-214）之间存在相互抑制关系：SHVV-P的过量表达会抑制IFN-α的产生，而miR-214的高表达可以缓解这种抑制作用[25]。因此，深入研究P蛋白在介导SHVV免疫逃逸中的具体作用具有重要的研究价值。这些发现不仅有助于理解SHVV的致病机制，还为开发针对P蛋白的药物或减毒疫苗等新型抗病毒策略提供了理论基础。
本研究以SHVV-P为靶点，利用蛇头鱼作为模型生物，系统地鉴定SHVV-P的宿主相互作用蛋白，并进一步研究其在免疫逃逸中的分子机制。首先，对感染SHVV后的蛇头鱼脾脏组织进行转录组测序，筛选差异表达基因；随后通过共免疫沉淀结合质谱分析鉴定与P蛋白相互作用的宿主蛋白，并通过AlphaFold3结构预测、分子对接、共免疫沉淀（Co-IP）、圆二色光谱和荧光共定位实验验证这些相互作用。此外，还对候选相互作用蛋白进行了生物信息学分析和功能鉴定，并研究了它们对病毒复制的影响。最后，通过结构建模、与截短突变体的共免疫沉淀和共定位实验，确定了SHVV-P与关键宿主蛋白之间的相互作用域，为它们的相互作用机制提供了初步见解。这项研究增强了我们对SHVV分子致病机制的理解，并为开发新型抗病毒策略提供了理论基础。
实验片段
鱼细胞、病毒和质粒
本研究中的所有动物和细胞实验均获得了西北农林科技大学动物伦理与福利委员会的批准（批准编号DK2022005），并严格遵循机构指南进行。
实验用蛇头鱼长度为8.0±0.9厘米，重量为13.0±1.4克，购自广东省佛山市。实验前，这些鱼在实验室的循环水系统中适应了两周。
转录组分析显示SHVV感染后抗病毒通路上调，并确定TBK1为病毒P蛋白的结合靶点
为了研究宿主对SHVV感染的反应，我们对感染病毒后的蛇头鱼进行了转录组测序。分析结果显示，SHVV感染导致4904个基因的差异表达，其中2260个基因上调，2644个基因下调（变化倍数≥2；调整后的p值≤0.05；图1A）。基因本体论（GO）富集分析表明，差异表达基因主要与细胞成分相关。
讨论
通常，病毒在宿主体内的成功感染和高效复制需要克服多种生物学屏障[32]。这一过程不仅依赖于病毒与宿主细胞的随机相互作用，还取决于病毒能否克服宿主的结构和化学防御机制[33]。即使突破了初始屏障，病毒仍可能被宿主复杂的免疫系统识别和清除[34]，[35]。此外，病毒复制完全依赖于宿主提供的能量。
结论
总之，本研究揭示了新型弹状病毒SHVV的一种免疫逃逸机制：病毒P蛋白靶向TBK1的ULD结构域，抑制宿主的先天抗病毒信号通路。这些发现揭示了弹状病毒之间共有的免疫逃逸策略，并为开发广谱抗病毒治疗提供了理论基础。
CRediT作者贡献声明
张书鹏：撰写——初稿、方法学、研究、概念构建。杜慧：撰写——初稿、可视化、验证、研究。黄俊伟：撰写——初稿、可视化、验证、研究。孔楚政：撰写——审稿与编辑、研究。李森：资源提供、数据分析。王超：资源提供、数据分析。马海翔：资源提供、数据分析。刘涛：资源提供、数据分析。王高学：撰写——审稿与编辑。
资助
本研究得到了深圳市科技计划（JCYJ20230807111459009、JCYJ20250604185728037）、广西自然科学基金（2024GXNSFAA010004）、国家自然科学基金（32303067）、广西海洋天然产物与组合生物合成化学重点实验室开放项目（GXMNPCBC-2023-04）、玉林中医药真草研究所开放基金（YLDQ-2024-02）和中国博士后科学基金的支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
