基于天然颜色的Fe?O?@PMAA@IgG纳米探针的侧向流动免疫测定法，用于快速检测SARS-CoV-2

《International Journal of Biological Macromolecules》：Lateral flow immunoassay of Fe 3O 4@PMAA@IgG nanoprobe for quick detection of SARS-CoV-2 based on natural color

SARS-CoV-2抗原检测采用低成本侧流免疫层析法，通过Fe3O4@PMAA@IgG纳米探针实现快速（1分钟）且灵敏度与ELISA相当的检测，单样本成本仅0.13美元，显著低于传统RT-QPCR和ELISA方法。

　　

Fangjun Wu|Juan Sun|Zheng Nie|Fujie Lai|Xudong Yang|Shaoyang Chen|Yang Wang

江苏科技大学材料科学与工程学院，镇江，212003，中国

摘要

随着SARS-CoV-2疫情逐渐常态化，每年感染这种新型冠状病毒的患者数量仍然很高。因此，人们迫切需要能够快速且经济高效地进行诊断测试。传统的诊断方法，如逆转录-定量聚合酶链反应（RT-QPCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA），成本较高且操作繁琐，不利于单样本检测。本研究开发了一种经济高效的侧向流动免疫测定方法，其灵敏度和简便性与ELISA和胶体金检测方法相当，能够快速且廉价地检测SARS-CoV-2抗原。首先通过溶剂热法合成了直径约为150纳米的Fe₃O₄颗粒，随后通过回流沉淀聚合反应制备了带有羧基的Fe₃O₄@PMAA颗粒。最后，利用标准的NHS/EDC方法将这些颗粒与抗SARS-CoV-2 N蛋白的IgG抗体偶联，得到了Fe₃O₄@PMAA@IgG纳米探针。该纳米探针被用作检测SARS-CoV-2核蛋白的免疫结合垫。基于纳米探针的方法在成本效益和时间效率方面表现出显著优势（检测时间仅需1分钟），每个样本的成本约为0.13美元。用于SARS-CoV-2抗原检测时，这一成本仅为RT-QPCR的0.02%和ELISA的0.05%。该侧向流动免疫测定的检测限为0.5 ng/mL。

引言

迄今为止，已在许多人群中观察到2019冠状病毒病（COVID-19）的持续感染情况[1]、[2]、[3]。据记录，该疾病的发病率显著高于季节性流感，主要影响老年人、婴儿、幼儿和其他免疫系统较弱的人群。显然，SARS-CoV-2有在人群中再次出现的潜力，对包括老年人和婴儿在内的免疫系统较弱者仍具有潜在危险。为了防止大规模的再次感染，迫切需要开发更经济高效的检测方法。因此，降低SARS-CoV-2检测的成本已成为当前体外诊断（IVD）中的一个关键挑战。

目前主要的检测方法包括基于核酸的实时逆转录聚合酶链反应（RT-QPCR）[4]、[5]、[6]、[7]、酶联免疫吸附测定（ELISA）[8]、[9]、[10]以及基于胶体金的侧向流动免疫试纸[12]、[13]、[14]、[15]。RT-QPCR因其卓越的选择性和灵敏度而被认为是SARS-CoV-2检测的金标准，但它存在一些局限性，包括高昂的操作成本（每十个样本约250美元）、需要专业技术人员以及较长的处理时间（至少2小时）。此外，在晚期感染中，由于样本采集不当和病毒分布不均，假阴性率可高达30-40%。尽管与RT-QPCR相比，基于ELISA的方法具有成本优势，但即使结合超顺磁颗粒技术[16]、[17]、[18]，ELISA方法仍存在经济限制。

传统的ELISA方法主要关注抗体检测，而抗体通常在感染后7-15天才会出现，这使得该方法不适合早期SARS-CoV-2的检测。相反，抗原检测方法更适合用于感染的初期阶段[19]、[20]、[21]。免疫层析技术具有多种优势，包括检测时间快、操作简单和成本低[22]、[23]、[24]、[25]。胶体金免疫试纸已被用于检测SARS-CoV-2核衣壳（N）蛋白——这是病毒RNA合成的关键成分，在感染早期阶段其血清浓度较高。然而，胶体金颗粒的生产成本非常高。因此，最近的研究提出了超顺磁纳米颗粒作为可行的替代方案，它们具有更好的表面功能化能力、更高的抗体偶联效率以及更低的合成成本[26]、[27]、[28]。

本研究探讨了一种基于Fe₃O₄@PMAA@IgG纳米探针的低成本快速SARS-CoV-2检测方法。通过溶剂热法合成了直径超过150纳米的Fe₃O₄颗粒，随后通过甲基丙烯酸（MAA）的回流沉淀聚合反应对其表面进行了修饰，得到了羧基化的Fe₃O₄@PMAA纳米颗粒[29]、[30]、[31]。利用传统的NHS/EDC偶联化学方法将抗SARS-CoV-2 N蛋白的IgG抗体偶联到这些颗粒上，制备出了Fe₃O₄@PMAA@IgG纳米探针[32]、[33]、[34]、[12]。这些合成的颗粒具有超顺磁特性，并在侧向流动免疫测定中得到了成功应用，通过系统的验证实验证明了其有效的SARS-CoV-2 N蛋白检测能力[35]、[36]、[37]、[38]、[39]、[40]。

材料与仪器

2,2-偶氮异丁腈（AIBN）、N,N'-亚甲基双(丙烯酰胺)（MBA）、乙二醇（EG）、乙酸钠（NaAc）、FeCl₃·6H₂O、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）、2-(N-吗啉基)-乙烷磺酸（MES）、Triton X-100、牛血清白蛋白（BSA）、乙腈、乙醇、甲基丙烯酸（MAA）均购自Aladdin生化科技有限公司（中国上海）。重组SARS-CoV-2 N蛋白的原核表达...

Fe₃O₄@PMAA@IgG纳米探针的制备原理

Fe₃O₄@PMAA@IgG纳米探针的完整合成过程如图1所示。首先通过回流沉淀法在预合成的Fe₃O₄微球表面聚合甲基丙烯酸（MAA），生成了Fe₃O₄@PMAA核壳颗粒。随后通过传统的NHS/EDC偶联方法将抗新型冠状病毒SARS-CoV-2 N蛋白的IgG抗体固定在微球表面...

结论

总结来说，本研究开发了一种低成本且有效的侧向流动免疫测定方法，用于检测新型冠状病毒（COVID-19）抗原。首先，采用改进的溶剂热法制备了直径为150纳米的Fe₃O₄颗粒。在此基础上，通过回流沉淀聚合反应在Fe₃O₄颗粒表面成功涂覆了聚甲基丙烯酸（PMAA）。然后通过将抗体偶联到Fe₃O₄@PMAA颗粒表面，制备出了Fe₃O₄@PMAA@IgG纳米探针...

CRediT作者贡献声明

Fangjun Wu：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，项目管理，概念构思。Juan Sun：实验研究，数据分析。Zheng Nie：验证，数据分析。Fujie Lai：实验研究，数据分析。Xudong Yang：资源准备，实验研究。Shaoyang Chen：验证，数据分析。Yang Wang：撰写——审稿与编辑，验证，数据分析。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号52303008）的支持。