通过热改性钴掺杂磷钙石涂层优化钛的骨整合

《ACS Biomaterials Science & Engineering》：Optimizing Titanium Osseointegration through Thermally Modified Co-Doped Monetite Coatings

这项研究报道了一种新型的水热合成钴掺杂磷钙石（Co-monetite）涂层，该涂层能显著提升钛植入物的表面性能。研究证实，该涂层具有仿生的微米级粗糙结构与超亲水性，并同时调控了成骨细胞的代谢活性、粘附、增殖以及成骨-血管生成相关基因的表达。这项发现为增强骨科和牙科植入物的骨整合提供了创新的多功能涂层策略。

　　

引言

自20世纪60年代Br?nemark的开创性工作以来，钛（Ti）因其良好的生物相容性、机械强度和耐腐蚀性，一直是骨骼重建领域的基石材料。然而，作为金标准的钛植入物仍面临临床挑战，尤其是在老年、患病和骨质疏松患者中，其骨整合延迟和种植体周围炎症问题依然存在。因此，对钛表面进行改性至关重要。在各种策略中，磷酸钙（CaP）涂层，特别是羟基磷灰石（HA）和磷钙石（Monetite），因其化学成分与骨矿物质相似且具有强大的骨传导性而备受关注。磷钙石（CaHPO₄）相较于HA具有更高的溶解度和生物可吸收性，这可能加速骨重塑和植入物的锚定。在此背景下，生物活性涂层已成为减少早期植入失败的主要方法之一，而磷酸钙仍是增强骨-植入体整合的有力候选者。特别是磷钙石，其生物活性和固有的可吸收性使其备受关注，能支持界面处的生理性重塑。

基于此原理，本研究在钛表面研究了磷钙石和钴掺杂磷钙石（Co-monetite）涂层。选择钴是因为其促血管生成作用及模拟缺氧信号的能力，从而有利于成骨-血管生成的耦合。最近的研究表明，Co²⁺可以促进内皮细胞募集和胶原沉积，这对早期骨愈合至关重要。尽管如此，钴掺杂磷钙石在钛表面的综合效应，尤其是其对成骨细胞-细胞外基质（ECM）相互作用和早期分子程序的影響，仍未得到充分探索。

实验部分

实验方法基于Zhou等人提出的方案进行改进，利用水热处理制备涂层。对于磷钙石涂层，使用的试剂浓度为：0.2 M CaCl₂、0.12 M NaH₂PO₄和0.1 M Na₂EDTA-2H₂O，溶于去离子水中。通过小心添加HCl或NH₄OH将溶液最终pH值调节至3.4–3.6。对于钴掺杂磷钙石涂层，除钙和钴的浓度分别为0.18 M和0.02 M外，所有试剂浓度保持不变。采用商业纯钛（cp-Ti, ASTM F67 GR2）作为基底，先进行打磨，然后用10%盐酸溶液处理。

涂层过程在定制设计的水热反应釜中进行，包含内衬聚四氟乙烯反应容器和不锈钢压力容器。反应釜在190°C下热处理8小时，然后在空气中200°C下进行后合成热处理2小时，以提高沉积磷钙石层的结晶度和相稳定性。

涂层后的样品通过X射线衍射（XRD）、扫描电子显微镜/能量色散X射线光谱（SEM/EDS）、轮廓测定法、接触角、细胞毒性测试（MTT和结晶紫）、MC3T3-E1细胞的形态学（SEM）评估、实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）进行基因表达分析以及通过酶谱法（Zymography）评估金属蛋白酶活性来进行表征。

结果

结构表征

X射线衍射（XRD）分析证实了在涂层样品中形成了单一相的磷钙石（三斜晶系），并观察到钴元素的均匀分布。结构分析表明，钴的掺入导致了晶胞参数减小，改变了局部化学键合，产生了压缩微应变，但未破坏磷钙石的相组成。这显示了Co²⁺（离子半径约0.745 ?）取代Ca²⁺（离子半径约1.000 ?）对晶体结构的影响。威廉姆森-霍尔（Williamson-Hall）方法估计的钴掺杂磷钙石晶粒尺寸减小，表明少量Co掺入对晶格产生了明显的晶体学效应。

表面形貌与润湿性

扫描电子显微镜（SEM）和轮廓测定法显示，涂层产生了具有峰谷结构的微结构表面，模仿了天然骨的形态。轮廓测定法定量证实，与抛光的纯钛基底（平均粗糙度Ra为0.398 μm）相比，磷钙石涂层（CaP）的Ra值显著增加至7.674 μm，钴掺杂磷钙石涂层（CoCaP）的Ra值为5.246 μm。这使它们处于已知最优于成骨细胞粘附和分化的微米级粗糙度范围（1–10 μm）内。

接触角分析显示，涂层材料表现出超亲水性。CaP涂层材料的平均接触角为11.00°，CoCaP涂层为10.10°，而未涂层材料为90.10°。这种高粗糙度与超亲水性的协同组合，能最大化与生物流体的初始相互作用，增强血清中粘附蛋白的吸附。

细胞生物学响应

细胞活力与粘附

MTT实验表明，与对照组相比，磷钙石和钴掺杂磷钙石条件培养基显著增强了MC3T3-E1细胞的代谢活性。然而，细胞粘附测定（结晶紫染色）显示，只有CoCaP条件培养基能显著增加细胞粘附。这表明两种处理通过不同的机制发挥作用。

细胞形态

SEM图像显示，经过3天和7天的培养，在钴掺杂磷钙石涂层表面的细胞展现出更好的粘附和铺展形态。

基因表达谱分析

基因表达分析揭示了与缺氧、血管生成、粘附、细胞周期和成骨分化相关通路的显著调节。

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  缺氧与血管生成相关基因：与对照组相比，CoCaP条件培养基处理的细胞中，HIF-1α（缺氧诱导因子-1α）和VEGF（血管内皮生长因子）的表达显著上调。值得注意的是，eNOS（内皮型一氧化氮合酶）的表达仅在CoCaP组中被显著诱导。
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  细胞周期调控：划痕实验表明，条件培养基均未损害MC3T3-E1细胞的伤口闭合能力。细胞周期调节因子分析显示，Cdk2、Cdk4和Cdk6的表达存在复杂且处理特异性的调节模式。
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  细胞粘附与细胞骨架相关基因：CoCaP条件培养基导致了关键粘附相关基因（整合素α1、整合素β1和黏着斑激酶FAK）的显著上调。此外，CoCaP处理独特地诱导了Cofilin（丝切蛋白）表达的急剧增加，表明活跃的细胞骨架重塑。
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  成骨标志物与细胞外基质成分：Runx2（成骨细胞分化的关键转录因子）仅在CoCaP处理中被强烈上调。相比之下，Osterix表达变化很小。BMP2（骨形态发生蛋白2）被所有材料条件培养基显著诱导。胶原基因Col1a1和Col3a1的表达在大多数处理中显著增强，CoCaP对Col3a1表现出特别强烈的影响。
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  基质金属蛋白酶活性与表达：酶谱法分析显示，所有处理组中MMP-2（基质金属蛋白酶-2）的活性均显著升高。MMP-9在CoCaP组中的基因表达和活性均显著增加。这种MMP-2/9活性的增强表明了活跃的细胞外基质（ECM）重塑过程。

讨论

本研究强调了磷钙石和钴掺杂磷钙石涂层在钛表面的物理化学特性及其对成骨细胞活性的后续影响。X射线衍射分析表明，钴的掺入并未破坏磷钙石的结构完整性，这对于其生物效能至关重要。由于Co²⁺的离子半径较小，取代了磷钙石晶体结构中的Ca²⁺，导致了晶胞参数减小和晶粒尺寸变化。

表面形貌和化学性质决定了成骨细胞的命运。轮廓测定法数据定量证实了扫描电镜观察到的微结构形貌。粗糙度值的增加，结合超亲水性（接触角约10°），创造了有利于粘附蛋白吸附和细胞附着的界面。这解释了观察到的成骨细胞粘附、铺展以及整合素和黏着斑激酶（FAK）信号上调的现象。

细胞的生存力、粘附和迁移结果支持了材料的生物相容性。基因表达谱分析揭示了钴掺杂磷钙石涂层对细胞行为的双重调节作用。

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  促进成骨：通过上调Runx2、BMP2以及胶原基因Col1a1和Col3a1，表明其能够增强早期的成骨细胞定向和基质形成。
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  促进血管生成：通过诱导HIF-1α、VEGF和eNOS的表达，模拟了缺氧环境，促进了血管生成相关信号。
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  增强细胞-基质相互作用：显著上调粘附相关基因（整合素α1/β1、FAK）和细胞骨架重塑蛋白Cofilin，改善了细胞在材料表面的附着和信号传导。
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  调节细胞外基质重塑：显著增加的MMP-2/9活性，表明涂层促进了活跃的基质降解与重塑，这对骨形成过程中的组织重组是必要的。
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  对细胞周期的影响：通过调节Cdk2、Cdk4和Cdk6的表达，影响了细胞周期动力学，但未损害整体增殖能力，这有利于后续的成骨分化过程。
  值得注意的是，钴掺杂磷钙石涂层对eNOS的特异性诱导具有重要意义，因为eNOS来源的一氧化氮在血管生成和成骨细胞活性中都扮演着关键角色。这种双重效应对于需要骨组织快速血管化的临床场景尤其有利。此外，CoCaP处理对Runx2的强烈上调（而非Osterix），暗示其优先激活成骨细胞谱系定向的早期阶段，而非终末分化。
  总结来说，本研究通过水热法成功地在钛表面开发了钴掺杂磷钙石涂层，它将磷钙石的骨传导特性与钴的促血管生成刺激相结合，旨在为骨整合过程中的骨再生创造一个仿生的微环境。这种多功能涂层策略有望改善钛植入物，特别是在具有挑战性的临床条件下的骨整合效果。