《ACS Infectious Diseases》：Bioorthogonal Click Chemistry for Antibody-Free Profiling of Acetylation, Propionylation, and Butyrylation in Pseudomonas aeruginosa and Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus
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本文报告了一种创新的无抗体酰化蛋白质组学富集方法，采用生物正交点击化学结合串联质谱技术，首次系统描绘了机会致病菌铜绿假单胞菌(PA)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的乙酰化、丙酰化和丁酰化修饰全景图。该方法快速、低成本且定量准确，克服了传统抗体法的局限性，揭示了酰化修饰在调控细菌代谢、应激响应、毒力和抗生素抗性等关键生理病理过程中的重要作用，为开发新型抗菌策略提供了新见解和通用技术平台。
引言
蛋白质翻译后修饰(PTM)对于细胞信号传导、蛋白质活性、定位、稳定性、基因表达和细胞周期调控等生物过程的调控至关重要。在细菌病原体中，酰化等PTMs正在成为应激响应、毒力因子表达以及病原体-宿主互作的关键调控因子。尽管如此，PTMs的机制作用在很大程度上仍未得到阐明，特别是在临床上重要的生物体中，如金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，它们是医院和社区获得性感染的主要原因。两者在临床上均表现出显著的抗生素耐药性和耐受性，PTMs代表了一个尚未充分探索的调控层面，可能为新治疗策略提供信息，或揭示病原体在宿主体内存活的机制。
酰化是一类由酰基转移酶催化的PTM，通过将酰基从酰基-CoA转移到蛋白质的Nα末端或赖氨酸残基的Nε基团来实现。Nε赖氨酸酰化是可逆的，在细菌转录、翻译、代谢和毒力的调控中起着重要作用。鉴于单个细菌基因组中存在大量酰基转移酶（最多可达75个），识别大多数细菌酰基转移酶的生理靶点非常繁琐，这限制了我们理解由酰化控制的调控网络。因此，研究人员将重点放在定义完整的酰化蛋白质组，即酰化组上，作为绘制各种细菌物种中酰化调控细胞网络的策略。
在铜绿假单胞菌中，几项全局酰化组研究已经绘制了赖氨酸酰化的范围。早期的研究发现在核心代谢、应激响应和毒力相关通路中广泛存在乙酰化蛋白的多样性。随后的分析同时描绘了乙酰化和琥珀酰化，进一步强调了代谢酶和膜相关蛋白的广泛修饰。更近期的一项全面乙酰化组研究揭示了不同铜绿假单胞菌菌株和生长条件下乙酰化的多样性，强调了这种PTM的动态性和环境依赖性。同样，在甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)中，对赖氨酸乙酰化和琥珀酰化的全蛋白质组分析记录了代谢和毒力相关蛋白的广泛修饰，表明酰化也是该生物体中重要的调控层。
值得注意的是，先前在铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌中的乙酰化组研究主要使用抗酰基赖氨酸抗体进行富集，这种方法虽然强大，但容易受到表位偏见的影响，可能无法捕获酰化修饰的全部动态范围。使用抗酰基赖氨酸抗体可能导致交叉反应性，以及对不同酰化赖氨酸残基的结合力存在差异。此外，这些抗体对紧密折叠蛋白质上的表位结合亲和力较低且可及性较差，这阻碍了酰化赖氨酸残基的检测。最后，探测不同链长的酰基修饰（例如，乙酰化、丙酰化或琥珀酰化）需要针对每种修饰类型的不同抗体，使得全面分析具有挑战性且资源密集。这些限制使得捕获酰化事件的全面范围和多样性变得困难，尤其是在响应应激或代谢适应动态发生的修饰。
为克服这些缺点，本研究开发了一种利用生物正交化学结合炔-叠氮环加成点击化学的方案，用于选择性地标记和富集机会致病菌铜绿假单胞菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)中的特定PTMs。生物正交化学依赖于掺入带有小的、化学活性基团（如叠氮基）的生物分子，这些基团能够在下游选择性地与探针反应，而不干扰天然细胞过程。虽然类似的方案已用于分析真核生物中具有生物正交化学的PTMs，但据我们所知，这是首次将生物正交点击化学应用于定义任何细菌物种的酰化组。该方法适用于不同的酰基类似物，为剖析不同微生物背景下PTM的调控提供了一个广泛适用的工具。通过该方案，可以将纯化标签或荧光团共价连接到叠氮酰化蛋白质上，从而选择性地富集这些蛋白质，随后通过质谱进行综合分析或通过凝胶内荧光进行可视化。
酰化蛋白质的标记在30-60分钟内于体内进行，从而可以捕获酰化事件的动态快照，并可结合细菌突变体或不同代谢生长状态进行分析。该方法快速，能富集感兴趣的酰化蛋白质，并增强了基于质谱的蛋白质组学分析的信噪比。
材料与方法
菌株、生长条件和化学品
铜绿假单胞菌UCBPP-PA14和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌JE2菌株均在LB肉汤中于37°C、250 rpm摇床过夜培养。铜绿假单胞菌在含琥珀酸盐(40 mM)的磷酸盐培养基中生长。金黄色葡萄球菌在含葡萄糖(13.88 mM)的完全限定培养基(CDM)中生长。
生长曲线
过夜培养物在各自最小培养基中稀释至OD600为0.4，并在96孔板中于37°C（板高度上有1°C梯度以防止冷凝）与不同浓度的叠氮酸或叠氮酸乙酯孵育。使用安捷伦BioTek Epoch 2酶标仪在24小时内每隔30分钟测量一次OD500（共49次读数）。每个条件包含生物学三次重复，误差条代表标准差。
叠氮功能化化合物处理和样品收集
简言之，将过夜培养物亚培养到最小培养基中（含40 mM琥珀酸盐），初始OD600为0.08，在37°C、250 rpm条件下摇动培养，直至OD600达到0.4–0.5。达到所需OD后，将培养物分装到18 mm玻璃管中（每管5 mL液体），并分别用10 mM（对于铜绿假单胞菌）或25 mM（对于金黄色葡萄球菌）的以下化学品处理：叠氮乙酸、叠氮丙酸、叠氮丁酸、叠氮乙酸乙酯、叠氮丙酸乙酯和叠氮丁酸乙酯（以及一个不添加任何化学品的培养基作为阴性对照）。将这些化学品在生长用培养基中稀释（对PA为200 mM，对SA为500 mM），以便将250 μL每种稀释化学品添加到5 mL培养物中以达到所需浓度。然后将其在37°C、250 rpm条件下重新孵育30分钟，随后离心沉淀并在?80°C下保存。
通过铜催化的叠氮-炔环加成对叠氮修饰蛋白质进行荧光标记
对于铜绿假单胞菌，将细胞沉淀在室温下解冻，并用BugBuster HT蛋白质提取试剂(100 μL)在摇动平台上裂解20分钟。金黄色葡萄球菌细胞在补充有溶葡萄球菌素(100 μg mL–1)的BugBuster HT蛋白质提取试剂(100 μL)中裂解。通过离心(21,300 × g， 10分钟，室温)澄清裂解液。将上清液移入新管中，使用Bradford法测定蛋白质浓度。每个点击化学反应(250 μL)包含蛋白质(75–100 μg)、HEPES(10 mM, pH 7.5)、CuSO4(100 μM)、THPTA(500 μM)、TAMRA–炔(2.5 μM)、盐酸氨基胍(45 mM)、抗坏血酸钠(45 mM)和水。预先混合CuSO4、THPTA和TAMRA–炔并在黑暗中至少孵育3分钟，然后与HEPES一起加入蛋白质混合物中。通过加入盐酸氨基胍和抗坏血酸钠引发反应，随后通过颠倒试管轻轻混合。反应在室温下黑暗中继续进行30分钟。通过加入400 μL甲醇、100 μL氯仿和300 μL水提取蛋白质（每次添加化学物质后涡旋样品）。样品以21,300 × g离心3分钟。移除上层（注意不要扰动两层边界处的极薄蛋白质层），随后用400 μL甲醇洗涤样品两次（以21,300 × g离心3分钟并弃去上清液）。打开管盖让残留甲醇蒸发。将蛋白质沉淀重悬于25 μL的4× Laemmli样品缓冲液和BugBuster HT蛋白质提取试剂的1:1混合液中，然后在95°C加热5分钟。将每个样品20 μL上样到4–20% Mini-PROTEAN TGX预制蛋白胶上；电泳在200 V下进行45分钟。使用Typhoon扫描仪对凝胶进行TAMRA荧光成像。然后用考马斯亮蓝和Fairbanks脱色液对同一凝胶进行染色，并用水脱色。对脱色后的凝胶进行成像。
用于质谱分析的叠氮酰基标记样品的制备
生长条件和叠氮处理与上述相同，不同之处在于将过夜培养物亚培养到100 mL适当的最小培养基和碳源中，并将起始OD600稀释至0.1。当OD600达到0.4至0.5之间时，将叠氮化合物在对应的最小培养基中稀释成工作储备液(50 mM)。然后，分别用叠氮乙酸乙酯(5 mM)、叠氮丙酸(5 mM)、叠氮丁酸(5 mM)或二甲基亚砜(DMSO)处理铜绿假单胞菌培养物。DMSO处理的样品用作阴性对照，以考虑富集过程中与DBCO-琼脂糖珠的非特异性结合。金黄色葡萄球菌培养物分别用叠氮乙酸乙酯(5 mM)、叠氮丙酸(5 mM)或DMSO处理。对于每种化合物和生物体，培养物进行了生物学五次重复。
蛋白质提取和用于蛋白质组学分析的点击化学富集
对于铜绿假单胞菌，将细胞沉淀在室温下解冻，并用BugBuster HT蛋白质提取试剂(500 μL)补充100× Halt蛋白酶抑制剂鸡尾酒(5 μL)，在SCILOGEX SCI-0180-S轨道摇床上70 rpm裂解20分钟。对于金黄色葡萄球菌，细胞沉淀用BugBuster HT蛋白质提取试剂(500 μL)、溶葡萄球菌素(100 μg mL–1)和100× Halt蛋白酶抑制剂鸡尾酒(5 μL)在37°C、70 rpm摇动下裂解30分钟。裂解液在室温下以21,300 × g离心10分钟。将上清液移入新的1.7 mL管中，并使用Bradford法在96孔板格式下用BioTek Epoch 2酶标仪测定蛋白质浓度。通过用SDS(1% w/v于PBS中)将样品稀释至1 mL，使每种裂解液的最终浓度达到3 mg mL–1。加入新鲜配制的氯乙酰胺(120 mM，悬浮于SDS(0.8% w/v于PBS中))以阻断游离巯基形成二硫键。样品在65°C黑暗中孵育，使用Eppendorf Thermomixer R以1,200 rpm摇动30分钟。接下来，为了变性蛋白质并提高叠氮基团用于点击反应的可及性，将尿素(1.6 M)和NaCl(0.17 M)的PBS溶液加入样品中。DBCO-琼脂糖珠（含有环辛炔环和炔基）用SDS(0.8% w/v于PBS中)以1:1比例洗涤三次，每次500 × g离心1分钟。为了进行点击反应，将洗涤并重悬的珠子(1.2% v/v)添加到蛋白质样品中，并在室温、黑暗、70 rpm旋转下在Thermo Scientific Digital Cel-Gro组织培养转子上孵育过夜。
第二天，在生物安全柜中，移除上清液，用水(1 mL)洗涤珠子。向每个样品中加入DTT(1 mM)于SDS(0.8% w/v于PBS中)中，并在70°C孵育15分钟。孵育后，弃去上清液，加入新鲜的氯乙酰胺(40 mM)以防止二硫键重新形成。样品在室温、黑暗、70 rpm旋转下在Thermo Scientific转子上孵育30分钟。接下来，将树脂转移到BioRad Poly-Prep色谱重力柱中，并用5 mL SDS(0.8% w/v于PBS中)和尿素(8 M)于Tris(1 M, pH 8)中洗涤八次，第二次洗涤后盖上盖子并在室温孵育30分钟。最后，用5 mL乙腈(ACN)(20% v/v)洗涤柱子八次，盖上盖子并在室温孵育10分钟。最后一次洗涤后，盖上柱子底部，用ACN(10% v/v于碳酸氢铵(50 mM)中)重悬树脂。重悬后，将珠子转移到新的1.7 mL EP管中，在室温下以2,000 × g离心5分钟，弃去上清液直至剩余100 μL。为了生成肽段，将测序级胰蛋白酶(1 ng μL–1)溶解于ACN(10% w/v于碳酸氢铵(50 mM)中)并添加到每个样品中。将管子置于Eppendorf Thermomixer R中，37°C、1,200 rpm摇动18小时。
第二天，在生物安全柜中，离心样品，将含有消化肽段的上清液转移到新的1.7 mL管中。用150 μL ACN(20% v/v)洗涤树脂两次，并将洗涤液与上清液合并。样品最后离心一次，并将剩余上清液添加到新管中。将合并的上清液管置于Eppendorf Vacufuge Plus中，在4°C过夜直至完全干燥。样品在?20°C保存，直至运送进行液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)分析。使用S-Trap样品处理技术将蛋白质从珠子上洗脱并消化成肽段。
肽段样品的LC-MS/MS分析
取等体积回收的样品进行LC-MS/MS分析。色谱分析在Thermo Vanquish Neo UHPLC仪器上以“加热捕集-洗脱，反向冲洗”模式进行。肽段在PepMap Neo捕集柱上以5 μL min–1的流速脱盐和浓缩。使用Aurora Ultimate色谱柱，以约350 nL min–1的流速在60分钟反相梯度上进行样品分离，随后用80% ACN洗脱10分钟。洗脱的肽段使用Thermo Scientific Orbitrap Exploris 480质谱仪（配备FAIMS pro Duo接口，通过Flex Ion源直接与UHPLC耦合）进行分析。使用Xcalibur 4.0软件在正离子模式下进行数据非依赖采集(DIA)。使用42个宽度为12 m/z、重叠1 Da的DIA采集窗口，在400–900 m/z的前体质量范围内测量。
蛋白质组学数据分析
使用Spectronaut版本19分析原始数据。使用Pulsar搜索引擎针对从NCBI下载的铜绿假单胞菌UCBPP-PA14和金黄色葡萄球菌JE2参考基因组搜索谱图。在“直接DIA”模式下进行谱图搜索。将半胱氨酸氨甲酰化设置为固定修饰，而蛋氨酸氧化和蛋白质N末端乙酰化设置为可变修饰。将消化参数设置为“特异性”和“胰蛋白酶/P, LysC”。允许最多两个漏切位点。要求在肽谱匹配、肽段和蛋白质组鉴定水平上使用“KR”诱饵生成规则计算的错误发现率小于0.01。如果一个蛋白质在五次重复的2/5中出现肽段，则被视为命中。
质谱数据的过滤和独特PTMs的鉴定
为了校正酰化数据集中的背景信号，将DMSO对照的蛋白质水平定量与每种酰化条件下观察到的定量进行比较。对于每种蛋白质，通过与DMSO对照进行统计比较，计算平均log2倍数变化以及相应的p值和Q值。仅保留具有统计学显著富集（高于DMSO背景，log2倍数变化高于2.0，且Q值 < 0.05）的蛋白质纳入最终的酰化数据集。
已发表的铜绿假单胞菌UCBPP-PA14乙酰化组比较分析
从已发表的铜绿假单胞菌UCBPP-PA14数据集中生成乙酰化蛋白质列表。将已发表乙酰化组列表中的UniProt标识符与本研究中识别的标识符（总蛋白质和log2倍数变化数据集）进行比较。通过使用BioCyc智能表格匹配NCBI蛋白质ID到UniProt ID，为本研究中的乙酰化蛋白质分配UniProt标识符。构建了一个包含已发表数据集或当前研究中所有独特UniProt标识符的综合矩阵。对于每种蛋白质，使用二元指标(“X”)来表示每项研究中的乙酰化命中。使用集合操作（交集、并集和差集函数）来量化三个数据集中乙酰化蛋白质的重叠和独特性，并进行分组以检测独特和共享的蛋白质组合。
铜绿假单胞菌独特酰化蛋白质的KEGG富集分析
从KEGG数据库下载铜绿假单胞菌UCBPP-PA14的基因-通路映射表。使用包含独特酰化蛋白质命中的数据集，通过将位点标签映射到通路条目，分配所有相关的KEGG通路标识符。通路描述从匹配的KEGG通路描述表中整合。为了评估通路富集情况，将样本集中的独特位点标签与完整的KEGG注释铜绿假单胞菌基因背景集进行比较。对于每条KEGG通路，统计样本和背景基因在通路中存在或不存在数量。使用Fisher精确检验评估样本基因中通路富集的统计学显著性，并按?log10转换的p值对结果排序。
金黄色葡萄球菌独特酰化蛋白质的KEGG富集分析
由于没有金黄色葡萄球菌JE2菌株的通路描述集，为了启用其KEGG通路注释，将JE2菌株的位点标签和蛋白质登录号映射到参考金黄色葡萄球菌USA300 (TCH1516)蛋白质组。通过全对全BLASTP分析评估金黄色葡萄球菌JE2和USA300 TCH1516之间的蛋白质序列相似性。在2,720个JE2蛋白质中，2,715个(99.82%)在TCH1516中具有对应的直系同源物，且至少有80%的氨基酸同一性和80%的覆盖率。下载了两个菌株的GenBank和GFF注释文件，并使用自定义解析脚本提取蛋白质编码序列(CDS)和基因特征，将JE2蛋白质与USA300位点标签关联起来。对于缺乏清晰映射的蛋白质序列，通过BLAST比对USA300蛋白质数据库，尽可能分配位点标签。从KEGG数据库检索USA300菌株的基因-通路映射表。如上所述，使用Fisher精确检验进行KEGG富集分析。
MRSA和MSSA乙酰化组的比较分析
为了将本研究中识别的乙酰化蛋白质组(MRSA)与先前发表的Bian等人的MSSA乙酰化组进行比较，首先将所有蛋白质映射到通用标识符空间。对于我们的数据集，使用UniProt ID映射服务将NCBI RefSeq蛋白质ID转换为UniProt登录号。将得到的UniProt登录号过滤，仅保留对应于金黄色葡萄球菌亚种STAA8的条目，以匹配Bian等人使用的菌株背景。使用Python比较基于UniProt的蛋白质列表（MSSA和MRSA）。通过上述的KEGG通路富集和Fisher精确检验分析MRSA数据集中独特的蛋白质。
结果
叠氮酸和乙酯在铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌中选择性标记酰化蛋白质
我们试图比较铜绿假单胞菌UCBPP-PA14和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)之间乙酰化、丙酰化和丁酰化的动态，并确定每种生物是否表现出独特的酰化组特征。虽然已在铜绿假单胞菌PAO1和UCBPP-PA14中进行了广泛的乙酰化组分析，并且在甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)菌株中也有分析，但迄今为止尚无研究在任何铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌物种中表征丙酰化组或丁酰化组。此外，尚未在MRSA菌株中进行酰化组研究。为了填补这些空白，我们使用叠氮乙酸、叠氮丙酸和叠氮丁酸化合物作为生物正交标记探针，通过点击化学富集、SDS-PAGE和质谱定量，监测铜绿假单胞菌和MRSA中的翻译后酰化。先前在哺乳动物细胞中的研究表明，这些叠氮化合物可以被内源性哺乳动物酰基转移酶机制识别并掺入为PTMs。
为了测试这些叠氮类似物是否能在铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌中有效标记酰化蛋白质，我们首先检查了它们的细胞摄取和掺入效率。先前的研究表明，用酯基团掩蔽叠氮酸的极性羧酸酯基团可以增强膜通透性和细胞摄取，提高它们作为代谢探针的效用。一旦进入细胞，内源性酯酶会水解乙酯，释放游离的叠氮酸，随后内源性酰基-CoA合成酶将其转化为CoA硫酯。得到的叠氮酰基-CoA作为酰基转移酶的底物，能够通过翻译后修饰实现赖氨酸残基的叠氮功能化酰化。为了确定支持标记且不施加代谢应激的条件，我们确定了每种化合物
