便携式荧光检测法用于水中粪便污染物的快速现场检测

《ACS Sensors》：Rapid Onsite Detection of Fecal Contamination in Water Using a Portable Fluorometric Assay

本文报道了一种创新的便携式荧光试纸检测方法，结合智能手机驱动的3D打印光学装置，实现了水中粪便指示色素（FIP）尿胆素（UB）的“滴加-检测”（drop-&-detect）式快速、超灵敏现场分析。该方法通过对玻璃纤维试纸条进行硅烷功能化和氯化锌浸渍优化，显著增强了UB-ZnII复合物的荧光响应，可在1分钟内实现亚纳摩尔级别的检测。研究成功应用于河流和污水处理厂的实际水样检测，满足世界卫生组织的RE/ASSURED标准，为现场水质监测提供了强大工具。

　　

粪便污染与水安全

水中的粪便污染对公共卫生构成重大风险，尤其当污染水源用于饮用和食品生产时。世界卫生组织估计，全球至少有20亿人使用受粪便污染的饮用水。传统水质检测方法依赖于粪大肠菌群等指标，通常耗时（18-24小时）、昂贵且需要专业人员操作，限制了其可及性。因此，开发快速、低成本、易于操作的现场检测技术至关重要。

检测策略与目标分析物

与缺乏特异性的化学指标如氨（NH₃）和硫化氢（H₂S）不同，尿胆素（UB）是一种粪便指示色素，是血红素代谢的副产物，由所有哺乳动物通过尿液排泄，是粪便污染的特异性化学标志物。然而，现有的UB检测方法如气相色谱、液相色谱等，成本高昂且被束缚在实验室内。经典的Schlesinger测试（利用锌盐与UB在醇介质中形成荧光复合物）也存在荧光增强弱、信号随时间衰减以及实际水样中腐殖质干扰等问题。因此，迫切需要开发一种便携、灵敏、快速的现场FIP检测技术。

研究方法与试纸条设计

本研究致力于开发一种光化学方法，用于痕量粪便色素的现场检测。核心是构建一种多功能测试条，其设计原则是结合界面、表面、超分子和配位化学。试纸条采用“滴加-检测”概念进行初步水质筛查。通过化学剪裁试纸条以增强UB与锌盐的复合物形成，从而优化荧光产率。

试纸条结构设计：如图2所示，试纸条采用多层架构。首先，整个玻璃纤维条用疏水性硅烷（如三甲氧基辛基硅烷，TMOS）涂层进行功能化。这一步有三个功能：防止样品液滴在疏水区域外不受控制地扩散；简化后续浸渍步骤，使过量的氯化锌溶液从疏水部分流走，仅在亲水检测区形成浸渍；以及由于两亲性硅烷与疏水性硅烷的低混溶性，两亲性硅烷主要在疏水改性载体上形成一层，而不是将检测区域的整个条带厚度转化为两亲性区域，从而实现了锌盐浸渍的垄断。随后，在疏水涂层上创建一个两亲性检测点，使用的是两亲性硅烷3-(双(2-羟乙基))氨基丙基三乙氧基硅烷（BHEAPTES）。最后，将检测区浸渍在30 mM的ZnCl₂水溶液中并干燥。这种设计避免了水样液滴在整个试纸条中扩散和吸附，使得发光物种（Zn^II盐、UB分析物）的组分仅在检测区顶层局部浓缩，从而实现灵敏检测并最大限度地减少散射。

硅烷涂层优化与极性调控：为了找到最佳的硅烷组合，研究了一系列单独涂层的GF条带，并通过元素分析和评估其对UB-Zn^II复合物荧光的影响进行表征。如图3所示，涂有BHEAPTES的条带显示出最高的荧光强度，发射最大值λ_em为518 nm，表明该条件下UB-Zn^II复合物是主要物种。而涂有TMMS的条带发射最大值在500 nm，表明未结合的UB占主导。光谱数据表明，疏水性本身不能解释BHEAPTES条带信号最强的现象。接触角测量显示，TMOS和TEDS涂层的条带疏水性强，液滴接触角大，阻碍润湿；而BHEAPTES涂层条带则被完全润湿。由于BHEAPTES能产生最高的荧光增强，而TMOS和TEDS则显示出最弱的发射和相反的疏水性，因此结合BHEAPTES与TMOS被选为最可行的体系（GF/TMOS/BHEAPTES），用于实现图2a的设计。扫描电子显微镜图像显示，TMOS涂层不会引起纤维表面明显的形态变化，而BHEAPTES在检测区的二次涂层则产生了强吸附球形颗粒的涂层和巢状结构，进一步浸渍ZnCl₂不会影响其形态。

通过Zn^II配位实现信号放大：在选择最佳的BHEAPTES涂层后，研究进一步考察了不同锌盐阴离子（如乙酸根、硝酸根、氯离子、高氯酸根、四氟硼酸根、硫酸根）对UB-Zn^II复合物荧光的影响。如图5所示，在试纸条上，ZnCl₂产生了最强的荧光增强。推测小而紧密配位的Cl^-有助于[UB-Zn^II]Cl复合物整体疏水性的形成，从而最有利于其容纳在两亲性BHEAPTES层中，实现最大荧光增强。研究优化了浸渍液浓度，发现用30 mM ZnCl₂溶液浸渍条带，对含1 μM UB的样品能产生最大荧光。

检测性能表征

采用优化后的GF/TMOS/BHEAPTES/ZnCl₂试纸条，对其分析性能指标进行了评估。使用两种基于智能手机的光学装置（SOS1仅激发光束中有一个透镜；SOS2在激发和发射光束中各有一个透镜）进行滴定实验。如图6所示，SOS1和SOS2的检测限分别为1.1 nM和0.5 nM，动态工作范围超过3个数量级，测量不确定度≤15%，这对于（半）定量现场检测非常有利。

针对快速现场方法，响应动力学和总检测时间至关重要。已知UB-Zn^II复合物在溶液中的荧光会随时间衰减，但测试显示，GF/TMOS/BHEAPTES/ZnCl₂条带的信号在15分钟内表现出良好的稳定性。在SOS1中监测时，信号稳定性稍差，但在5分钟内仍能进行可靠测量。信号衰减可能与荧光光谱仪和SOS1激发和监测的区域不同有关，但该效应可重现，且操作简单，信号稳定性已足够满足快速检测需求。

实际水样分析

为了评估天然水体中溶解性有机物或金属离子的潜在干扰，研究收集了不同河流水样并添加UB进行加标回收实验。如图7a所示，除了在特伦特河水样中有轻微低估外，其他实际水样中UB的回收率都非常好。为了便于现场半定量分析，研究引入了光谱匹配的BODIPY染料（Me₄BDP）作为参考，制作了三点校准参考条。通过建立参考染料信号与实验室获得的UB校准曲线之间的关系，可以在现场通过测量参考条和样品条来估算样品中的UB当量浓度。这种最小化校准方法在模拟实际场景的测试中表现良好。

为了验证硅烷处理带来的信号增益，进行了对比测试。如图S27所示，在存在硅烷层的情况下，信号强度明显增加了7倍。此外，研究发现使用带有微吸头的商用滴眼剂可以取得可比的结果，提高了检测方法的普及性。该检测方法对地表水中常见的金属阳离子也表现出良好的抗干扰能力。

现场应用案例

最后一系列实验涉及对德国柏林一家污水处理厂进水口和出水口的实际水样进行现场直接分析。如图8所示，采用GF/TMOS/BHEAPTES试纸条（有/无ZnCl₂浸渍）和SOS2光学装置进行检测。由于进水样颜色深暗，进行了稀释处理。结果显示，在所有情况下，无ZnCl₂的条带信号低于有ZnCl₂的条带，且增强倍数在进水样中最高（2.2倍），在出水样中最低（1.2倍）。通过现场使用参考条构建虚拟校准曲线，可以估算出样品中的粪便指示色素（以UB当量浓度计）。对于光学特性具有挑战性的样品（如未稀释的进水），直接使用会导致结果不一致，但简单的系列稀释可以解决此问题，获得可靠结果。该单点检测法对于假定未受污染的样品（如污水处理厂出水），定量限（LoQ）≥10 nM。研究还通过实验室光谱分析和标准添加法验证了现场检测结果的可靠性。这些结果共同表明，所开发的便携式荧光检测法能够在天然淡水基质中快速、灵敏、现场地检测粪便污染，验证了其作为实用、可现场部署的水质评估工具的潜力。

总结与展望

总而言之，本研究成功开发了一种结合智能手机3D打印光学装置的快速、灵敏的现场水质筛查工具。关键步骤包括试纸条的硅烷涂层和锌盐浸渍，优化了其疏水性、UB结合能力和信号放大作用，实现了无需溶剂、危险化学品或复杂液体操作的灵敏检测。这种“滴加-检测”方法使用商业化、低成本、广泛可得的组件，可在不到一分钟内检测到纳摩尔级别的尿胆素。与现有的化学和生物学方法相比，该方法在简便性、速度、成本和现场使用方面表现卓越。通过进一步优化光学装置或使用石英纤维纸代替玻璃纤维纸（可显著提高信噪比，如图S38和表S6），灵敏度还可进一步提高。该方法非常适合作为痕量粪便指示色素现场分析可靠的初筛检测手段，满足RE/ASSURED标准，为缺乏精密仪器地区的水质监测提供了实用解决方案，有力地展示了材料、界面、表面、超分子和配位化学相结合在开发强大快速检测方法中的巨大潜力。