《Journal of Proteome Research》：High-Throughput Proteomics Sample Preparation Using a 96-Channel Pipettor and Magnetic Pin Device
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本文介绍了一种经济高效的磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）半自动化工作流程。该方法结合手动操作的Gilson Platemaster P220 96通道移液器与VP Scientific磁针装置（MagPin device），在96孔板格式下，于2天内即可完成蛋白聚集捕获（PAC/SP3）、脱盐、磷酸化肽段富集（phosphopeptide enrichment）及二次脱盐。该方案显著减少了操作者的工作量与样本间差异，为复杂翻译后修饰（PTM）分析提供了一种高重现性的实用解决方案。
文章内容归纳
引言
基于质谱的蛋白质组学领域正在快速发展，这得益于近期推出的、可实现高通量样本分析的新平台。这些仪器能在几分钟内定量数千种蛋白质。然而，液相色谱-质谱（LC–MS）分析能力的显著提升，对应地要求样本处理能力也得到增强。任何自下而上的蛋白质组学实验都始于样本，并最终生成可供LC–MS分析的洁净肽段。因此，样本制备方法涉及蛋白提取与溶解、还原与烷基化、酶切以及去垢剂去除等关键步骤。实践中，这些步骤通常可通过三种主要方式实现：直接酶解后通过固相萃取（SPE）在肽段水平纯化；蛋白沉淀后消化沉淀物；以及基于分子量截留（MWCO）滤膜的过滤辅助样本制备（FASP）方法。所有这些方法都可以实现自动化，但完全自动化，特别是对于磷酸化蛋白质组学等涉及多步骤的复杂工作流程而言，通常成本高昂且复杂。本文旨在提供一种基于96通道手动设备的实用中间解决方案。
方法
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细胞培养与蛋白提取：实验使用了THP-1细胞、大肠杆菌（Escherichia coli）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。细胞在适宜条件下培养后收集，使用SEPOD缓冲液等裂解液进行蛋白提取，并通过BCA法测定蛋白浓度。
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沉淀辅助捕获：样本用CAA/TCEP进行还原烷基化后，在羟基磁珠上进行蛋白沉淀。沉淀物用80%乙醇洗涤，随后在含有胰蛋白酶和LysC的碳酸氢铵溶液中过夜消化。消化后，收集上清用于后续分析。
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Oasis HLB板脱盐：脱盐使用自行填充的Oasis HLB板进行。将肽段样本加载到吸附剂上，用0.1% TFA洗涤，最后用特定体积的乙腈（ACN）和TFA混合液洗脱，以获得所需浓度的肽段溶液。研究表明，脱盐应在肽段与吸附剂重量比为1:100的条件下进行，以确保高保留率。
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磷酸化蛋白质组富集：脱盐后的肽段在80% ACN、0.1 M乙醇酸和5% TFA的溶液中使用Zr-IMAC HP磁珠进行磷酸化肽段富集。结合后，依次用不同组成的洗涤缓冲液清洗磁珠，最后用1% NH4OH溶液洗脱磷酸化肽段。整个过程利用MagPin磁针装置在孔板间转移磁珠，以提高重现性。
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高pH值分级分离：为评估Oasis HLB材料用于肽段预分离的适用性，在0.1%三乙胺背景下，用一系列浓度递增的ACN溶液（3%至50%）对结合在吸附剂上的肽段进行分步洗脱。但结果显示，各馏分间肽段重叠较多，效果不如传统C18材料。
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液相色谱-质谱数据采集与分析：未经修饰的肽段和磷酸化肽段分别使用不同内径的色谱柱和流速进行分析。质谱采用数据非依赖性采集（DIA）模式。原始数据使用Spectronaut软件进行处理和分析，使用严格的错误发现率（FDR）控制。
结果与讨论
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引入自填装Oasis HLB板：为降低部分使用96孔板时的成本，研究团队开发了一种低成本的自填装Oasis HLB板。该材料由亲脂性二乙烯基苯（DVB）和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮（NVP）共聚而成，具有混合模式保留机制，可在水相和有机相中润湿，从而获得更可重现的回收率。制造过程见视频S1，制成的板如所示。
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Oasis HLB材料的液体滞留特性：研究发现，每毫克Oasis HLB材料在离心后仍能保留约1.3微升的0.1% TFA水溶液。这一特性对于精确控制后续步骤（如磷酸化富集）的溶剂组成至关重要，使得无需蒸干即可直接调节洗脱液至目标ACN浓度。
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Oasis HLB材料在去除脂质污染和高pH分级中的局限性：尽管Oasis HLB应用广泛，但研究证明其无法像传统C18材料那样通过调节ACN浓度有效分离肽段和脂质污染物。同时，尝试将其用于高pH反相分级时，由于材料亲水组分（NVP）的存在，其分离正交性不如纯疏水的C18材料，导致馏分间重叠严重，仅有约30%的肽段为单一馏分独有，效果不理想。相关优化实验结果见和。
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基于96通道设备的磷酸化蛋白质组学流程：整个工作流程的核心是利用Gilson Platemaster P220 96通道移液器和VP Scientific MagPin磁针装置。流程包括PAC消化、脱盐、磷酸化肽段富集和二次脱盐，完整展示了每一步所需的设备和耗材，见。其中，磷酸化富集后的脱盐步骤是必要的，因为实验发现，不进行此步骤会直接导致色谱柱性能快速下降。
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PAC消化可通过短暂移液实现：一个关键发现是，在PAC工作流程中，磁珠无需在整个消化过程中保持悬浮状态。实验比较了不同时间（0.5分钟至过夜）的振荡或移液处理对消化效率的影响。结果显示，仅需2分钟的移液上下吹打，使磁珠与蛋白酶溶液充分接触，随后让磁珠沉降并静置过夜，即可实现高效且重现性更好的消化。过夜振荡反而会增加样本间的变异性。消化效率对比见。这一发现大大简化了自动化需求，无需加热振荡器。
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PAC和磷酸化蛋白质组学流程的性能评估：为评估工作流程的准确性和重现性，研究团队制备了由大肠杆菌、酿酒酵母和人（THP-1细胞）蛋白按不同比例混合的三物种样本集。主成分分析（PCA）显示，总蛋白和磷酸化位点水平的定量数据均能清晰地按预期比例聚类，证明了流程的准确性。通过分析变异系数（CV）和观测值与理论值的均方根误差（RMSE），评估了流程的重现性。结果表明，在蛋白水平，样本处理引入的额外变异约为1-2%，而在磷酸化位点水平约为2-3%，显示出良好的重现性。三物种混合实验的设计、PCA结果及比率恢复情况见。
结论
本研究描述的基于96通道手动设备的工作流程，并非旨在替代功能齐全的全自动液体处理系统，而是为希望实现完全自动化的实验室提供了一个优秀的过渡方案。该方法成本相对较低（整个系统搭建成本低于2万美元），操作简单，无需专门的编程培训，使研究人员能够熟悉96孔板格式的操作，并深入理解样本处理中的细微之处和潜在变异来源。通过优化，特别是证明了PAC消化无需持续振荡，以及引入了低成本自填装Oasis HLB板和高效的磁珠转移方案，该工作流程为复杂磷酸化蛋白质组学分析提供了一种高效、稳定且易于实施的高通量样本制备解决方案。
