《Nature Communications》：High efficiency CRISPR knock-in demonstrates that TCF1 is insufficient to reverse T cell exhaustion
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本研究针对T细胞耗竭这一限制癌症免疫治疗的关键难题，探讨了关键转录因子TCF1能否将终末耗竭的T细胞逆转为功能性的干细胞样状态。研究人员利用优化的CRISPR敲入技术，在体内模型中分别构建了持续性和条件性过表达TCF1的T细胞。结果发现，持续性（而非条件性）TCF1过表达能扩增干细胞样T细胞库，表明TCF1虽可延缓干细胞样T细胞的分化，但不足以逆转终末耗竭细胞的命运，为理解T细胞耗竭的稳固性提供了新视角。
在对抗癌症和慢性感染的战场上，我们体内的CD8+T细胞（一种关键的杀伤性免疫细胞）有时会陷入一种名为“耗竭”的疲惫状态。这种状态并非简单的休息不足，而是细胞功能被深度抑制，丧失了持续攻击和清除病原体或肿瘤细胞的能力。更棘手的是，耗竭的T细胞并非铁板一块，它们内部存在一个功能等级体系：处于顶层的是一群数量稀少但至关重要的“干细胞样T细胞”，它们自我更新能力强，是响应当前免疫疗法（如PD-1抑制剂）的主力军；而处于底层的则是大量的“终末耗竭T细胞”，它们功能严重受损，似乎已“积重难返”。已知转录因子TCF1是形成和维持干细胞样T细胞群所必需且充分的“指挥家”。但一个悬而未决的核心问题是：这位指挥家的魔力是否强大到足以让已经“沉沦”的终末耗竭T细胞“浪子回头”，重新变回充满潜力的干细胞样状态？如果能实现这种“逆转”，无疑将为突破当前免疫治疗的瓶颈带来革命性希望。为了解答这一关键问题，一支研究团队在《Nature Communications》上发表了一项重要研究。
研究团队主要运用并优化了一套高效率的CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）敲入技术，该方法适用于小鼠体内的T细胞耗竭模型。他们利用该技术，精准地改造T细胞，构建了两种模型：一种是持续性过表达TCF1的T细胞，另一种则是在T细胞已分化为CX3CR1+中间耗竭状态后，再条件性诱导TCF1过表达的T细胞。
持续性而非条件性TCF1过表达扩大了干细胞样T细胞库
研究人员比较了两种过表达模型对干细胞样T细胞数量的影响。他们发现，在慢性病毒感染或肿瘤的小鼠模型中，从初始阶段就持续性过表达TCF1的T细胞，能够显著增加干细胞样T细胞（以TCF1+PD-1+Tim-3-表型为特征）的比例和绝对数量。这表明TCF1的持续存在有利于维持和扩增这个关键的细胞亚群。
条件性TCF1过表达无法逆转CX3CR1+T细胞的耗竭分化轨迹
然而，当研究者在T细胞已经经历慢性抗原刺激，并分化成为CX3CR1+的中间耗竭状态（一个更分化、更偏向终末耗竭的过渡阶段）后，再通过条件性诱导系统开启TCF1过表达，结果却截然不同。尽管此时TCF1被强制高表达，但这些CX3CR1+T细胞并未“回溯”成为TCF1+的干细胞样状态。它们的表型、转录组特征和功能（如细胞因子产生和增殖能力）仍然与对照的条件性过表达组相似，维持在更分化的耗竭路径上。
TCF1过表达的时机决定了其对T细胞命运的调控能力
综合以上结果，研究清晰地表明，TCF1对T细胞命运的调控存在严格的“时间窗口”依赖性。在分化早期（或持续存在时），TCF1能够塑造并维持干细胞样特性；然而，一旦T细胞越过了某个特定的分化临界点（例如进入到CX3CR1+状态），即使再强制引入TCF1，也无法将其拉回到干细胞样谱系。这意味着耗竭T细胞的分化进程具有高度的稳固性和方向性，TCF1在此过程中更像是一个“早期命运决定者”和“分化延缓剂”，而非一个万能的“逆转剂”。
该研究的结论深刻揭示了T细胞耗竭状态的层级稳固性。TCF1虽然是形成和维持干细胞样耗竭T细胞（Texstem）的必要且充分条件，但其功能具有严格的上下文依赖性和时间敏感性。它能够“延缓”干细胞样细胞向终末状态的分化，从而扩大功能性前体细胞池，但“不足以”将已经步入更分化路径（如CX3CR1+中间耗竭状态）的细胞“逆转”或“重编程”回干细胞样状态。这一发现对于理解T细胞耗竭的生物学本质和开发下一代免疫疗法具有重大意义。它提示我们，单纯地在晚期肿瘤或慢性感染阶段上调TCF1可能无法有效重建抗肿瘤免疫力。未来的治疗策略可能需要更早地进行干预（例如在耗竭进程初期增强TCF1活性），或者需要寻找能够与TCF1协同作用、真正突破分化壁垒的全新靶点，以实现对终末耗竭T细胞的功能“解救”。这项研究通过精密的遗传学模型，为T细胞耗竭领域的核心争议提供了关键证据，推动了该领域从现象描述向机制解析的更深层次发展。
