将能够降解石油的本土细菌引入土壤清洗过程中，以提高修复效率

《Journal of Cleaner Production》：Integrating indigenous petroleum-degrading bacteria into soil washing for enhanced remediation efficiency

石油污染土壤修复中本地微生物群落的作用及优化策略研究。通过五个油场土壤样本的16S rRNA测序和石油降解菌株筛选，结合响应面法（RSM）优化得出32%细菌接种量与75%>0.02mm颗粒土壤比例组合效率最高，实验验证其可靠性，并发现高效修复土壤微生物群落相似度高，COG分析显示更多参与烃类运输与降解的酶蛋白。

　　

李倩伟|张淼|刘浩|王华珍|刘道清|陈春茂

中国石油大学重油加工国家重点实验室，北京，102249，中国

摘要

土壤清洗是一种高效且经济可行的方法，用于修复受石油污染的土壤；然而，本土微生物的作用常常被忽视。在本研究中，对五个受石油污染的油田土壤中的本土细菌群落进行了表征，并从这些土壤中筛选出能够降解石油的菌株，对其进行培养后再重新引入土壤中，以提高异地土壤清洗的效果。通过响应面方法（RSM）预测了最佳的石油去除条件，结果表明细菌接种量为32%（体积比），且土壤颗粒中大于0.02毫米的颗粒占比为75%。实验验证证实了这些条件能够实现最高的石油去除效率，进一步证明了RSM模型的可靠性。高通量16S rRNA测序显示，来自新疆（XJ）、辽河（LH）和长庆（CQ）油田的土壤在操作分类单元（OTU）相似性方面具有较高水平。基于直系同源群（COG）分析的功能预测表明，这些土壤中参与碳氢化合物运输和降解的微生物蛋白更为丰富。玻璃蚀刻微模型实验进一步证实，添加本土Sphingomonas属菌株可以增强污染物的脱附和去除效果。总体而言，本研究强调了本土微生物群落在土壤清洗中的关键作用，并为石油污染土壤的修复提供了一种可持续的方法。

引言

快速的工业化和城市化导致全球能源消耗持续增加（Tong, 2024）。根据《2023年国际能源展望》，预计到2050年液体燃料的总使用量将达到240夸德，其中工业部门贡献了37.5%（EIA, 2023）。石油烃类作为关键的能源来源和工业原料，由于使用不当、泄漏和意外溢出等问题引发了严重的环境问题（Caetano et al., 2024）。总石油烃类（TPH），包括烷烃、环烷烃和多环芳烃，由于其稳定性、疏水性和持久性，对环境构成重大风险，从而导致土壤和其他介质的长期污染（Ambaye et al., 2022）。这些风险表现为土壤肥力下降和微生物平衡失调，而土壤是主要受影响的介质（Wang et al., 2024）。TPH复杂的迁移行为和持久性使得土壤修复成为一个极具挑战性的过程（Gautam and Jeong, 2021; Li et al., 2020a）。

目前，针对总石油烃类（TPH）污染土壤的修复技术包括物理方法（如土壤清洗、蒸汽萃取、挖掘）（Choi et al., 2020）、化学方法（如光催化、电化学处理和化学氧化剂，以改善土壤渗透性和降低污染风险）（Chandrasekhar et al., 2021; Fardin et al., 2021; Gautam et al., 2019; Gautam and Jeong, 2022）、生物技术（如生物修复、植物修复、堆肥）（Bajagain et al., 2020; Crognale et al., 2020; Tanzadeh et al., 2020）以及组合方法。其中，土壤清洗因其简单性、处理时间短和成本效益高而广受认可（Fanaei et al., 2020）。该过程主要依靠各种清洗剂（如水、表面活性剂、酸或碱）来促进TPH的脱附和溶解（Mirzaee and Sartaj, 2022; Qi et al., 2021）。以往的研究主要集中在优化物理化学参数上，包括表面活性剂类型、浓度、pH值、反应时间和液固比，以提高污染物去除效率（Zoghi and Mafigholami, 2023）。然而，这些优化往往忽略了本土微生物群落的作用，而这些微生物群落是污染土壤中固有的，并且能够降解石油烃类（Kostka et al., 2011）。本土石油降解细菌的存在和活性可以通过促进碳氢化合物的分解、减少对化学添加剂的依赖以及提高整体修复效率来显著影响清洗效果。重要的是，环境因素会显著调节微生物的代谢活性和碳氢化合物的生物可利用性，从而决定修复效果。物理化学参数（如温度和pH值）会调控酶的转化速率、膜传输动力学和微生物群落的功能。同时，土壤质地和团聚体结构决定了碳氢化合物的吸附-解吸行为和孔隙尺度上的氧气传递。这些结构限制通常导致细粒质、富含粘土的土壤中的生物降解速度较慢或不完全（Haghollahi et al., 2016; Mekonnen et al., 2024; Semple et al., 2003）。这种被忽视的微生物贡献是实现可持续和有效土壤修复的关键因素。

本土微生物在维持当地生态系统中发挥着重要作用，通常被认为是生物修复、生物降解和陆地石油泄漏产生的有机污染物生物转化的关键因素。与真菌和藻类相比，细菌通常是降解石油烃类最活跃的微生物。当土壤受到石油污染时，本土石油降解细菌的数量和群落显著增加，比未受污染的土壤高出2到4个数量级（Kostka et al., 2011）。迄今为止，已有超过30个细菌属被报道能够参与石油烃类的生物降解，包括Sphingomonas、Bacillus、Pseudomonas、Gordonia、Brevibacterium、Aeromicrobium和Mycobacterium等（Chunyan et al., 2023; Das and Chandran, 2011）。Sphingomonas因其能够降解多环芳烃而受到广泛关注，这种细菌常存在于受污染的土壤中，可能为生长和繁殖提供额外的能量和碳源（Asaf et al., 2020）。在TPH降解过程中，参与碳氢化合物降解的酶（尤其是膜结合的单加氧酶和双加氧酶）以及生物表面活性剂的分泌在决定降解效率方面起着关键作用（Hou et al., 2018; Rodríguez-Uribe et al., 2021）。这些生物表面活性剂可以降低表面张力，增加石油烃类在土壤中的溶解度和分散性，从而提高其生物可利用性并促进进一步的微生物降解（Sharma et al., 2023）。因此，微生物代谢和生物表面活性剂产生的协同效应不仅加速了碳氢化合物的分解，还提高了污染物在土壤基质中的迁移性，促进了更有效的修复。

本研究的目的是探讨本土石油降解微生物群落在提高受石油污染土壤清洗效率中的作用。从五个具有代表性的油田采集了土壤样本，并使用高通量16S rRNA测序对本土细菌群落进行了表征。我们评估了从这些受污染土壤中分离出的代表性石油降解菌株在异地土壤清洗过程中对总石油烃类（TPH）去除的效果。此外，还采用了响应面方法（RSM）来优化应用条件，并确定细菌接种量与土壤颗粒大小的最佳比例。对微生物群落结构的比较分析进一步揭示了影响清洗效率的关键生物因素。本研究为将本土石油降解细菌与土壤清洗技术相结合提供了实用见解，为提高石油污染土壤的修复效果提供了一种有效且可持续的方法。

章节片段

土壤采样

从中国的五个不同油田采集了土壤样本：（1）辽河（LH），（2）新疆（XJ），（3）长庆（CQ），（4）江苏（JS）和（5）胜利（SL）油田。土壤样本从地表0到20厘米深度采集，并在运输到实验室之前储存在无菌采样袋中。

土壤样本的物理和化学分析

根据推荐的土壤测试程序，研究了土壤的物理和化学性质，包括土壤pH值、含水量、阳离子交换容量等

不同油田采集的土壤特征分析

中国拥有多样化的土壤类型，质地从沙质到壤土再到粘土不等。此外，油田分布广泛，主要位于国家的东北部、西北部和西南部地区。为了确定各种土壤的最佳清洗处理方法，从中国的五个典型油田地点采集了土壤样本，并分析了土壤的物理和化学性质（表1）。土壤有机质（SOM）的含量范围为5.67%至

结论

本研究采用了响应面方法（RSM）和16S rRNA扩增子测序，开发了一种结合本土微生物群的改进土壤清洗策略。RSM模型确定了最佳操作条件：细菌接种量为32%（体积比），土壤颗粒中大于0.02毫米的颗粒占比为75%，从而实现了最高的石油去除效率。验证实验证实了该模型的可靠性，建立了明确的正相关关系

CRediT作者贡献声明

李倩伟：撰写——初稿，监督，资金获取，正式分析，概念构思。张淼：撰写——初稿，方法学，研究。刘浩：研究，数据管理。王华珍：方法学，数据管理。刘道清：撰写——审稿与编辑，概念构思。陈春茂：资源协调，正式分析。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者感谢国家自然科学基金（资助编号：22478427和41701352）的财政支持。李倩伟特别感谢中国石油大学科学基金会（资助编号：2462023BJRC006）的财政支持。