含有ATP酶的蛋白脂质体作为微反应器，模拟微生物代谢过程以实现生物能源合成

《Journal of Colloid and Interface Science》：Proteoliposomes containing ATPase as microreactors to mimic microbial metabolism for bioenergy synthesis

人工生物合成ATP的新方法通过仿生微反应器实现。利用ADH和ALDH催化乙醇至乙酸的级联反应，结合质子梯度驱动ATP合酶，30分钟内ATP浓度达6.3 μM。该设计绕过复杂代谢网络，直接将低成本乙醇转化为高价值生物能源载体。

　　

Xuanze Meng|杨旭|易佳|荣舒|李子博|李俊白

中国科学院化学研究所胶体、界面与化学热力学国家重点实验室，北京国家分子科学实验室（BNLMS），中国北京 100190

摘要

学习和模仿自然界生物体的固有代谢途径已成为实现腺苷三磷酸（ATP）人工仿生合成的关键方法。我们构建了一个受微生物乙醇代谢途径启发的仿生微反应器。微反应器中装载的乙醇脱氢酶（ADH）和醛脱氢酶（ALDH）可以催化乙醇向乙酸的级联反应。这一产生质子的反应与嵌入蛋白脂质体中的ATP合成酶在空间上耦合，从而建立跨膜质子梯度，驱动ATP合成酶合成ATP。生成的ATP浓度在30分钟内可达到6.3 μM，这一数值相当高。该微反应器有效地重建了将化学能转化为生物能的乙酸发酵过程的核心步骤。这项工作展示了一种将低价值、易获得的基本化学产物转化为通用生物能量载体ATP的新颖高效途径，无需依赖复杂的代谢网络。这样的设计为理解和工程化细胞代谢提供了基础模型。

引言

腺苷三磷酸（ATP）是活细胞中的通用能量货币[1] [2]。它对于包括核酸、蛋白质和脂质的生物合成，以及细胞运动、代谢和细胞间信号传递等一系列生物过程至关重要[3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10]。因此，体外仿生合成ATP不仅有助于深入理解基本的能量转换原理，而且在构建人工细胞方面也具有巨大潜力。受线粒体和叶绿体的启发，先前的研究开发了多种模仿氧化或光合作用磷酸化以实现ATP合成的人工能量转换系统[11] [12] [13] [14]。最近的研究重点是通过优化电子转移和放大质子梯度来提高ATP的生产效率[15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22]。尽管这些方法表现出显著的ATP生成能力，但开发更实用、更稳健、更可持续的仿生ATP合成平台仍然是一个重大挑战。

像面包酵母和乳酸菌这样的发酵微生物在日常生活和工业生物技术中不可或缺。它们将葡萄糖和其他营养物质转化为有价值的工业基础原料，包括乙醇和乳酸，用于食品生产、生物质能源和医学工程[23] [24] [25] [26] [27]。然而，对于生产这些物质的细胞来说，这些物质主要是代谢副产物，其化学能大多未被充分利用，导致大量能量浪费。此外，它们的固有细胞毒性限制了大多数生物体的利用，尽管它们为生产者提供了竞争优势[28] [29] [30] [31] [32] [33]。相比之下，某些专门的微生物进化出了独特的代谢途径，能够利用这些有毒底物中的化学能来生存[23] [34] [35]，以醋酸菌为例，它们以在醋生产中的重要作用而闻名。这些细菌通过乙醇脱氢酶（ADH）和醛脱氢酶（ALDH）依次将乙醇氧化为乙酸，在两个脱氢步骤中都使用β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）作为必需的辅因子[36] [37] [38] [39] [40] [41]。在有氧条件下，产生的乙酸进入克雷布斯循环生成ATP；否则，它作为发酵产物被排出。这种代谢策略增强了醋酸菌在复杂环境中的生存能力，尤其是在与产乙醇微生物共存时。

受这种自然能量捕获机制的启发，我们开发了一种仿生纳米结构，能够通过类似乙酸发酵的酶级联反应将乙醇的化学能转化为通用的生物能量载体ATP。如图1所示，该系统构建在多孔二氧化硅（H-SiO₂）支架上。H-SiO₂的内部空腔作为必需辅因子NAD⁺的储存库，而外部表面则固定了ADH和ALDH。这种空间限制确保了酶之间的紧密接近，这对于高效的中间体转移和级联反应进程至关重要。这种装有酶的颗粒随后被封装在含有ATP合成酶的蛋白脂质体内，形成一个集成的仿生反应器。当引入乙醇时，固定的酶催化NAD⁺依赖的级联反应，在蛋白脂质体膜上建立质子梯度[42]。该梯度驱动ATP合成酶旋转，从腺苷二磷酸（ADP）和无机磷酸盐合成ATP。为了维持连续运行，级联过程中产生的还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）通过跨膜电子穿梭不断重新氧化为NAD⁺，从而建立了一个自维持的循环，实现连续的ATP生产[12] [43] [44]。通过绕过活细胞固有的复杂调控网络和结构障碍，这种合理设计的纳米结构能够以显著的效率直接将丰富的低成本化学物质乙醇转化为ATP。与之前模仿线粒体氧化磷酸化或叶绿体光合作用磷酸化的仿生方法不同，我们的系统利用简单的、可扩展的发酵化学过程来驱动ATP合成。这项工作代表了人工能量转换的一个范式转变，将研究范围从传统的细胞器模仿扩展到受微生物代谢启发的设计。它提供了一个稳健、低成本且可扩展的ATP生成平台，解决了无细胞生物催化、合成生物学和可持续生物能源技术中的长期挑战。

材料与方法

本研究中使用的所有材料、设备和实验方法均详细记录在补充材料中。

微反应器支架材料的制备与表征

为了构建类似细胞的层次化仿生反应器，选择了H-SiO₂颗粒作为支架，因为它们具有优异的生物相容性、高稳定性和大容量。为了实现酶和辅因子的共封装以高效催化，通过逐步过程从H-SiO₂制备了修饰有金纳米颗粒的SiO₂（Au-SiO₂）。首先通过St?ber方法合成H-SiO₂颗粒，然后对其表面进行3-氨基丙基修饰

结论

在这项研究中，我们通过超分子组装构建了一个集成的人工微反应器，用于高效合成ATP。通过合理的纳米结构工程，我们将乙酸发酵途径的核心步骤与封装在蛋白脂质体内的ATP合成酶耦合，实现了空间有序的酶级联反应。这种分隔化的结构使得化学能可以直接从低成本的乙醇转化为高价值的能量货币

CRediT作者贡献声明

Xuanze Meng：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学，研究，概念化。Yang Xu：方法学，研究，概念化。Yi Jia：撰写 – 审稿与编辑，验证，监督。Rong Shu：形式分析。Zibo Li：验证，监督，方法学，形式分析。Junbai Li：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目管理，资金获取。

资助

作者感谢来自国家重点研发计划（项目编号：2022YFA1503001）和国家自然科学基金（项目编号：22193031、22172174、22572069）的财政支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。