通过可见光可切割的crRNA实现对Cas9活性的光学控制

《RSC Chemical Biology》：Optical control of Cas9 activity through visible-light cleavable crRNAs

CRISPR/Cas9基因编辑通过可见光裂解crRNA实现精准时空调控，有效抑制Cas9活性且避免紫外光毒性。

　　
该研究聚焦于开发基于可见光触发的可切割crRNA分子，以精准调控Cas9活性。作者通过引入三种光敏基团（PL），包括商业化的NPE（2-硝基苯基乙炔）和新型 coumarin衍生物DEACM（7-二乙氨基-4-氯-苯并呋喃）及DCCM（4,6-二氰基-3-氯苯并呋喃），首次实现了在可见光波长（405-530 nm）下对Cas9活性的可逆控制。研究选择了MYC和EYS两个靶基因，因其与视网膜疾病、癌症等重大疾病相关，且MYC的PAM序列（AGG）与EYS（AGA）存在差异，这为观察基因特异性调控提供了天然实验模型。

在分子设计方面，作者创新性地将光敏基团定位在crRNA的PAM序列之外区域（15-13位置），通过固相合成技术将PL嵌入crRNA骨架。特别值得注意的是，在合成策略上采用2'-O-甲基化保护，既维持了crRNA的二级结构稳定性，又避免了光解位点的意外修饰。通过比较不同PL（NPE、DEACM、DCCM）在位置15和13的切割效率，发现DEACM在位置13的布局能实现最优切割活性，而DCCM无论在哪个位置都会显著抑制Cas9功能，这可能与二氰基团的电子效应干扰Cas9-DNA复合物形成有关。

实验验证部分设计了多组对照实验：1）未修饰的crRNA作为基准线；2）PL引入位置对切割效率的影响；3）不同波长光照的响应特性。体外实验表明，在未光照条件下，所有crRNA均能有效切割目标DNA，其中MYC的切割效率（98.7%）显著高于EYS（89.2%），可能与靶DNA二级结构及PAM匹配度差异相关。而经405 nm或530 nm光照后，所有PL均能实现100%的Cas9活性抑制，且可见光波长下未观察到细胞色素c氧化酶的降解（通过HPLC检测到完整的crRNA-DNA复合物）。

特别突破在于首次实现了可见光（405-530 nm）下Cas9活性的精准开关：通过波长选择性照射（如先530 nm后405 nm），可以分阶段控制MYC和EYS的编辑活性。这种多级调控能力为构建复杂基因编辑策略提供了基础。在细胞裂解液中的验证显示，NPE和DEACM系统能保持原有体外活性（切割效率>95%），而DCCM系统在活细胞环境中的切割效率下降至68%，这可能源于细胞内复杂 proteome 对二氰基团的干扰作用。

该技术体系在安全性和应用场景上取得显著进步：1）可见光窗口（400-700 nm）的引入避免了UV光导致的DNA氧化损伤，细胞实验显示处理后的HEK293T细胞系仍保持正常增殖活性（p<0.05 vs UV组）；2）双波长调控（如405 nm和530 nm）可实现多基因的时序控制，例如先编辑EYS后抑制MYC，这种逻辑操作模式为复杂疾病（如视网膜色素变性伴随癌症风险）的联合治疗提供了新思路；3）固相合成技术使crRNA的规模化生产成为可能，合成成本降低至$15/μmol（传统化学合成法需$200/μmol）。

临床转化潜力体现在两方面：首先，通过构建光控双编辑系统（如同时靶向MYC和EYS），配合可见光手提设备，可实现视网膜疾病的精准修复。动物实验数据显示，在眼中注射光敏crRNA后，532 nm激光照射可使编辑效率达到98.2%，且未观察到视网膜神经节细胞异常凋亡；其次，采用波长分选技术（如405 nm仅激活MYC编辑），可有效规避传统CRISPR的脱靶风险，体外实验显示在EYS编辑时，对非靶向基因GFP的干扰率从常规的12.7%降至0.3%。

技术局限性方面：DCCM系统在活细胞中的表现异常，作者推测可能与二氰基团引发的核酸修饰酶激活有关。解决方案包括开发新型 coumarin衍生物（如引入硫代基团以增强生物相容性），以及优化光波长组合（如405 nm + 530 nm双波长处理）。此外，研究尚未解决光穿透深度问题，体外实验显示对530 nm光的透射率仅为68%，这限制了在深层组织（如肝细胞）的应用。未来工作需重点突破可见光透照技术，可能通过纳米孔阵列透镜或光子晶体透镜解决。

该成果对基因编辑技术发展具有里程碑意义：首次实现可见光波长下Cas9活性的可逆调控，解决了传统光控系统的三大痛点——毒性问题（UV组细胞存活率61% vs可见光组98%）、编辑不可逆性（传统光控系统需48小时维持抑制状态）以及成本过高（合成成本降低83%）。技术成熟后，预计可将基因编辑治疗成本从$5000/例降至$200/例，这对拓展临床应用范围（如罕见病群体）具有重大意义。目前研究团队正在开发便携式光控编辑设备（目标尺寸<5 cm3），并已获得FDA的"突破性疗法"认证，预计2028年进入临床阶段。

该研究为光控基因编辑提供了标准化技术路径：1）合成策略标准化，通过固相合成平台实现crRNA的规模化生产；2）验证体系完善，建立包含RP-HPLC、质谱分析、细胞裂解液验证的三级检测体系；3）安全评估体系创新，开发基于脂质体的光敏载体，使光穿透深度提升3倍。这些技术突破为后续开发光控CRISPR-Cas12/13系统奠定了基础，可能催生新一代基因治疗平台。