《Journal of Environmental Chemical Engineering》：Development of a high-throughput sensitive SB-PCR assay for rapid detection of laboratory-escaped antibiotic resistance genes
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实验室废水中的抗生素抗性基因（ARGs）检测存在低效和高成本问题，本研究提出新型固液两相PCR（SB-PCR）平台，通过悬浮阵列技术实现液相快速扩增与固相捕获标记同步进行，检测限低至5 fM，动态范围达三个数量级，与实时定量PCR结果高度一致，为实验室逸出ARGs的动态监测提供高效解决方案。
严凌峰|刘胜南|曹荣|尼尔加兹·阿扎德|魏家进|龙和辉|张黎明|卢卓轩
中国海南省海口市海南医学院第二附属医院生命科学与医学技术学院热带疾病控制国家重点实验室；心血管外科，571199
摘要
实验室废水中含有携带抗生素抗性基因（ARGs）的工程细菌和抗生素，这种多重药物压力会促进多重耐药菌株的产生并加速ARGs的传播。因此，对这些废水中的ARGs进行动态监测至关重要。本研究提出了一种基于悬浮阵列技术的新型固液两相PCR（SB-PCR）平台，用于快速检测实验室来源的ARGs。该平台的自补充机制通过在单一溶液中进行固液两相扩增来实现：在液相中，常规多重PCR快速扩增目标序列；同时，在羧基磁性荧光编码微球（称为CMF-beads）的表面，固定的引物捕获并延伸这些扩增产物，并进行生物素标记，以便后续使用链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE）染色和流式细胞术检测。实验结果表明，该平台具有高灵敏度，并且具有明显的动态检测范围。值得注意的是，SB-PCR检测方法对所有ARGs都具有良好的动态检测范围（R2 > 0.99），覆盖三个数量级：hph、aph(3')-Ia和aadA的动态范围为76.0 fM至78.1 pM，cat为305 fM至313 pM，aac(3)-IV、aacC1和erm(B)为1.22 pM至1.25 nM。不同ARGs的检测限（LODs）有所不同，aph(3')-Ia的检测限低至5 fM，71%的测试ARGs（包括aadA、cat、hph、aac(3)-IV、aacC1）的LODs低于90 fM，而erm(B)的LOD为468 fM。此外，该平台表现出高特异性，并与实时定量PCR（R2 > 0.97）具有强一致性。回收率在85.59%至115.98%之间，证实了其良好的定量准确性。
引言
抗生素耐药性是全球主要的严重和紧迫的公共卫生挑战之一。根据世界卫生组织的数据，每年有数百万人死于抗菌素耐药性[1]，而且这一数字还在持续上升[2][3]。抗生素耐药性的出现主要是由于细菌在抗生素的选择压力下通过基因突变或水平基因转移获得抗生素抗性基因（ARGs）[4][5][6]，从而发展出对抗生素的耐药性。这些ARGs不仅可以在同一物种的细菌之间传播，还可以通过质粒和转座子等常见的移动遗传元件在不同细菌物种之间传播，从而加剧了耐药细菌的扩散[7][8]。在各种生物实验中，经常使用携带ARGs的工程细菌（如大肠杆菌）来筛选转化体。虽然这些携带ARGs的工程细菌在实验室研究中具有重要的应用价值，但它们也带来潜在风险。例如，在实验过程中，由于培养基泄漏、培养物溢出或生物安全柜内的气流扰动等原因，它们可能会进入实验室废水系统。更值得注意的是，实验室废水通常含有多种抗生素的混合暴露。这种多重药物压力环境会促使细菌发展出多重耐药表型，加速耐药基因的组装和传播[9]，并可能导致超级耐药细菌的出现。此外，这些ARGs可以与金属、微塑料或其他新兴污染物形成复合物，通过市政污水系统进入环境[10][11][12][13]，引发一系列严重的公共卫生和生态问题[15][16]。因此，动态检测逃逸到环境中的实验室ARGs对于快速确定其分布、传播途径和时间动态至关重要，从而预防和减轻其对环境和公共卫生的影响。
目前检测ARGs的方法存在显著局限性。传统的微生物培养方法需要在特定温度下培养至少24小时[17][18]，有些甚至需要长达3天[19]，而且不同菌株可能需要使用不同的培养基[20]，这使得该方法既耗时又效率低下。尽管实时定量PCR（qPCR）可以高度敏感地定量特定的ARGs，但其通量仍然较低，即使使用多重PCR，有限的荧光通道数量也阻碍了多个目标基因的同时检测[21][22][23]。同样，数字PCR（dPCR）是一种高度敏感的检测方法，但由于两个关键限制，也不适合在废水中高通量检测ARGs。首先，其多重扩增能力受到dPCR仪器中荧光通道数量有限的限制，这限制了单次反应中可以检测的目标数量。其次，该方法需要先进的仪器（如液滴生成器和液滴读取器）以及专门的技术专长来进行操作和数据分析，从而提高了实施门槛和总体成本[24][25][26]。宏基因组测序提供了对环境微生物组的全面分析，突破了传统方法在基因覆盖范围上的瓶颈。它还结合了功能基因注释和宿主追踪，揭示了ARGs的传播机制[27][28][29][30]。然而，高昂的测序成本、复杂的分析过程和较长的检测时间限制了其在常规检测中的广泛应用，而且宏基因组测序只能实现相对定量并提供静态相对丰度。高通量定量PCR（HT-qPCR）已成为ARG监测中广泛使用的靶向高通量检测技术，它继承了传统qPCR的核心原理，同时实现了多个目标基因的并行检测。其核心机制依赖于高密度微流控芯片，在单次实验中为数百个预先选定的目标基因构建独立的反应系统[31][32]。然而，这种方法依赖于定制的高密度反应芯片作为核心耗材。这些芯片通常是单次使用的，每次运行都需要消耗整个芯片，使得单个样本的检测成本相对较高。此外，HT-qPCR的检测范围严格限于芯片中预设计的引物集。如果研究项目需要添加或替换目标基因，则需要重新设计和制造新的芯片。这一过程通常需要几周的时间，并产生大量的定制成本，从而限制了该平台适应不断变化的研究目标的能力[33][34]。尽管电化学检测方法可以实现较低的检测灵敏度，但它们价格昂贵，无法满足高通量检测的要求[35][36][37]。总之，现有的ARGs检测方法往往受到效率低下和成本高的限制。未来的研究应优先开发具有高灵敏度、广谱覆盖、快速响应能力和成本效益的新检测系统。
为了解决这些限制，我们提出了一种基于悬浮阵列的固液两相PCR（SB-PCR）平台，可以在大约1小时内快速检测逃逸到环境中的实验室ARGs。SB-PCR平台通过其自补充机制表现出独特的特点，即液相扩增不断为固相上的多重反应提供模板。这种设计实现了高灵敏度和高通量检测能力的前所未有的结合。该方法建立了一种快速、经济高效且高度敏感的分析策略，用于动态监测逃逸到环境中的实验室ARGs，有助于人们快速了解逃逸ARGs的类型，从而预防和减轻它们对环境和公共卫生的潜在风险。
材料
羧基磁性荧光编码微球（称为CMF-beads）由中国海口市的Beadstar Biotechnology Co., Ltd.提供。本实验中使用的所有引物和模板，包括氨基修饰的引物和Cy3标记的探针，均由GenScript Biotechnology Corporation合成。dNTP和Bio-dCTP购自Thermo Fisher Scientific。DNA扩增试剂盒来自以下来源：Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd.的KAPA Taq HotStart PCR Kit
SB-PCR平台原理
如图1所示，SB-PCR利用CMF-beads作为功能化的固相载体，实现扩增过程的空间分离。在液相中，进行常规多重PCR以实现目标DNA序列的快速指数扩增，从而确保为后续固相反应持续提供模板分子。在CMF-beads的表面，固定的上游引物介导模板导向的延伸，结合生物素标记
结论
本研究提出了一种用于定量检测实验室废水中ARGs的新型SB-PCR方法。该方法所需的处理时间相对较短，整个过程仅需1小时。在多重扩增能力方面，与提供全面基因组信息的高通量测序和具有更高目标覆盖范围的高通量qPCR相比，SB-PCR的通量相对较低。然而，其优势在于灵活性：检测系统可以轻松调整
CRediT作者贡献声明
尼尔加兹·阿扎德：写作 – 审稿与编辑。曹荣：写作 – 审稿与编辑。刘胜南：方法学。严凌峰：写作 – 原始草案、方法学、实验研究。卢卓轩：写作 – 审稿与编辑、监督、项目管理、实验研究。张黎明：写作 – 审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念构思。龙和辉：方法学。魏家进：实验研究。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了中国海南省自然科学基金（编号822CXTD514）的财政支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
