《Journal of Environmental Chemical Engineering》：Viral persistence in soil: Insights from qPCR and cell culture detection of adenovirus
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微生物污染风险及检测方法比较研究。该研究通过对比细胞培养法与qPCR在半干旱气候下土壤中检测人腺病毒（HAdV）的效果，发现细胞培养法能准确反映夏季强光照下病毒失活率（0.36–0.93 day?1），而qPCR因检测非感染性基因组导致低估风险。
Soudabeh Ghodsi | Mahnaz Nikaeen | Sahar Gholipour | Hamid Reza Rahmani | Horieh Saderi
伊朗伊斯法罕医科大学健康学院环境健康工程系
摘要
在废水的可持续再利用和生物固体的土地施用过程中，微生物风险是一个主要的公共卫生问题。关于土壤中病毒颗粒数量及其持久性的准确定量数据对于进行可靠的风险评估至关重要。本研究比较了两种检测方法在不同环境条件下检测人类腺病毒（HAdV）的可靠性。实验中，将HAdV 5型接种到土壤样本中，并在不同季节（夏季和冬季）以及不同光照条件下（直射阳光和阴凉处）对其进行监测。通过HeLa细胞的细胞培养测定和定量实时PCR（qPCR）技术，在特定时间间隔内测量病毒浓度。结果显示，使用细胞培养方法时，HAdV的灭活速率为0.36–0.93 day?1；而qPCR分析显示，在整个研究期间病毒颗粒的灭活速率要低得多（0.005–0.04 day?1）。结果表明，细胞培养方法能够检测到病毒感染性的显著下降，尤其是在夏季和阳光下。相比之下，qPCR在整个研究期间未观察到病毒基因组的显著减少。这些发现表明，尽管qPCR具有高灵敏度和快速性，但它无法可靠地反映感染性病毒颗粒的持久性或准确评估相关的健康风险。此类信息对于公共卫生保护和环境政策制定中的决策至关重要。
引言
由于废水排放物和生物固体在环境和农艺方面的益处日益明显，近年来其土地施用变得越来越普遍[1][2]。气候变化、城市化和人口快速增长导致全球对食品需求的增加，加剧了对淡水资源的压力，尤其是农业灌溉方面的需求[3]。为应对水资源短缺问题，废水在农业中的再利用已成为一种实用且可持续的替代水源[4]。这种方法不仅增强了水资源有限的地区（尤其是干旱和半干旱地区）的粮食安全，还通过减少对传统淡水供应的依赖，提高了灌溉农业的韧性[5]。同样，作为土壤改良剂的生物固体也受到越来越多的关注，因为它们可以改善土壤的化学和物理性质[6]。此外，生物固体含有氮和磷等必需的大量营养素以及多种微量营养素，使其成为有价值的农业肥料[1]。然而，废水和生物固体土地施用带来的一个主要公共卫生问题是其中存在的微生物病原体可能对土壤造成污染，并随后转移到作物上[7]。因此，在干旱和半干旱地区，随着废水再利用和生物固体在农业中应用的持续增加，识别和评估与微生物感染（尤其是病毒病原体）相关的健康风险因素至关重要[8][9]。
研究表明，废水排放物和生物固体可能含有大量能够引起各种疾病（最常见的是胃肠炎[10][11][12]）的人类病原病毒。这些病毒颗粒可以污染农业土壤，并通过食用受污染的作物或农场工人意外摄入受污染的土壤而传播给人类[13]。近年来，人类腺病毒（HAdVs）受到了特别关注。HAdVs是一种双链DNA病毒，以其环境持久性和对氯化及紫外线（UV）等常见消毒方法的抵抗力而闻名。即使是在低感染剂量下，HAdVs也能引起多种疾病，其中40型和41型主要与胃肠炎相关[14]。与其他肠道病毒（如诺如病毒和肠病毒）不同，腺病毒全年都存在。由于这种持久性，美国环保署（EPA）已将HAdV作为废水再利用中微生物风险评估的病毒指标[2]。因此，准确检测和量化HAdV作为关键病毒指标对于有效的环境监测、健康风险评估以及制定有针对性的控制策略至关重要。
基于细胞培养的方法（包括斑块测定和组织培养感染剂量50%（TCID??）测定）通过观察易感宿主细胞中的细胞病变效应（CPE）来量化感染性病毒[15][16]。尽管这些技术提供了关于病毒传染性的宝贵信息，但它们劳动强度高、耗时较长，并且由于严格的培养要求以及检测某些病毒类型的局限性，在处理复杂的环境样本时往往不切实际[17]。相比之下，基于PCR的方法（如定量实时PCR（qPCR）具有高灵敏度，能够快速检测病毒基因组，即使在低浓度下也能识别HAdV。然而，PCR的一个主要局限性在于它无法区分感染性和非感染性病毒颗粒，这可能导致假阳性检测结果，从而高估相关的健康风险[16][18]。
鉴于准确检测和量化HAdV的重要性，本研究旨在比较两种分析方法——基于细胞培养的测定方法和定量PCR（qPCR）——在不同环境条件下检测土壤样本中腺病毒的数量。本研究的结果可以为选择有效的检测方法提供依据，以便更可靠地估计环境样本中的病毒污染情况并评估相关的公共卫生风险。
研究设计
从伊朗伊斯法罕地区具有代表性的农田中采集了一种壤粘土土壤，其质地由26%的沙子、45.5%的粉砂和28.5%的粘土组成。该地区属于半干旱气候，年平均气温为16.7°C，年降水量约为130毫米[19]。使用聚丙烯材料制作了八个矩形花盆，尺寸为81厘米（长度）× 31厘米（宽度）× 25厘米（高度），颜色为类似陶器的棕橙色。
结果与讨论
已有研究表明，基于粪便指示菌（FIB）的标准并不一定能充分保护人类健康免受废水再利用带来的风险。因此，建议采用定量微生物风险评估（QMRA）方法来更好地评估和管理与废水再利用相关的健康风险[22]。在这方面，美国环保署（EPA）已将HAdV指定为废水再利用中QMRA的病毒参考病原体[2]。
结论
本研究显示，在半干旱地区，由于温度较高、湿度较低和紫外线照射，土壤中的感染性HAdV会迅速失活，而病毒基因组则可以持续更长时间。研究结果突显了病毒传染性和基因组检测之间的关键差异，表明仅依靠qPCR可能会高估病毒的持久性和相关健康风险。因此，准确评估感染性病毒颗粒至关重要。
作者贡献声明
Horieh Saderi：资源获取、方法论。
Soudabeh Ghodsi：撰写初稿、方法论设计、实验实施。
Mahnaz Nikaeen：撰写、审稿与编辑、监督、资金筹集、概念构思。
Sahar Gholipour：方法论设计、数据管理。
Hamid Reza Rahmani：结果验证、方法论验证。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了伊斯法罕医科大学（项目编号3401799）的支持，作者对此表示衷心的感谢。
