N-(苯并呋喃-3-基甲基)异菧子衍生物作为潜在的SARS-CoV-2主要蛋白酶抑制剂：合成、生物评价、动力学分析及分子建模研究

《Journal of Molecular Structure》：N-(Benzofuran-3-ylmethyl)isatin Derivatives as Potential SARS-CoV-2 Main Protease Inhibitors: Synthesis, Biological Evaluation, Kinetic Analysis, and Molecular Modeling Insights

SARS-CoV-2主蛋白酶抑制剂研究：合成11种苯并呋喃取代的N-取代isatin衍生物WDa-k，通过FRET筛选及IC50测定发现WD-d、WD-f和WD-i抑制活性达微摩尔级，评估细胞毒性并采用分子模拟解析抑制机制。

　　

瓦格迪·M·埃尔德赫纳（Wagdy M. Eldehna）| 穆德夫库尔·伊斯兰·穆基姆（Md Sofequl Islam Mukim）| 穆罕默德·M·埃尔德苏基（Mohamed M. Eldesouki）| 莫哈茂德·A·埃尔哈萨布（Mahmoud A. El Hassab）| 雷汉·莫尼尔（Rehan Monir）| 穆罕默德·M·赫菲娜（Mohamed M. Hefina）| 西玛·M·哈梅德（Shimaa M. Hamed）| 莫斯塔法·M·埃尔巴达维（Mostafa M. Elbadawi）| 穆罕默德·埃拉加瓦尼（Mohamed Elagawany）| 阿什拉夫·K·埃尔-达马西（Ashraf K. El-Damasy）| 宋大根（Dae-Geun Song）| 哈特姆·A·阿卜杜勒-阿齐兹（Hatem A. Abdel-Aziz）

卡夫雷尔谢赫大学（Kafrelsheikh University）药学院药物化学系，埃及卡夫雷尔谢赫，邮政信箱33516

摘要

2019年末爆发的SARS-CoV-2大流行对全球健康和经济造成了严重影响。因此，抗病毒药物的设计和发现成为学术界和制药行业的首要任务。鉴于异黄酮骨架（isatin scaffold）已显示出良好的抗SARS-CoV-2活性，本研究利用该骨架开发了一组新的N-（苯并呋喃-3-基甲基）异黄酮衍生物（WDa-k），作为潜在的SARS-CoV-2主要蛋白酶（Mpro）抑制剂。首先通过FRET检测在100 μM的浓度下筛选所有候选分子对SARS-CoV-2 Mpro的抑制作用。随后评估了最有效抑制剂（WD-d、WD-f和WD-i）的IC50值。此外，还评估了这些化合物对正常IMR90细胞系的细胞毒性，以探讨其安全性。对三种最有效的抑制剂在不同浓度下进行了米氏动力学（Michaelis-Menten kinetics）研究，以阐明它们的作用机制和抑制模式。最后，通过分子建模预测了合成衍生物与Mpro结合位点的相互作用。

引言

COVID-19是由冠状病毒SARS-CoV-2引起的一种传染病。该病毒于2019年末出现，并迅速成为全球性大流行病[[1], [2], [3]]。SARS-CoV-2是一种正链RNA病毒，其RNA基因组的复制涉及一系列复杂的酶[4]。

截至2025年3月，全球已有超过700万人死于COVID-19[5]。病毒的快速传播以及德尔塔（Delta）和奥密克戎（Omicron）等变异株的出现，给现有的疫苗和治疗措施带来了巨大挑战[6]。SARS-CoV-2病毒对健康、经济和社会产生了深远影响[7]。尽管已经开发出针对该病毒的疫苗，但仍迫切需要发现有效的抗病毒药物来应对COVID-19，尤其是考虑到该病毒可能会长期存在[8]。

主要蛋白酶Mpro（也称为Nsp5或3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶（3CLpro）对SARS-CoV-2的生命周期至关重要，因此是开发抗病毒药物的主要靶点[9,10]。Mpro对于病毒的功能至关重要，因为它能催化多聚蛋白pp1a和pp1ab的水解，从而释放出16种非结构蛋白中的13种，这些蛋白对病毒复制和转录至关重要[11,12]。

Mpro活性位点的催化二聚体由Cys145和His41组成，这一结构有助于识别谷氨酰胺残基并促进特定残基后的肽键水解[13,14]。这种独特的底物特异性在人类蛋白酶中不存在，因此可以开发出毒性较低的选择性抑制剂。此外，不同冠状病毒（如SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV）中的Mpro高度保守[11,15,16]，使其成为开发抗病毒药物的最有希望的分子靶点之一。此外，不同冠状病毒变体中Mpro催化中心周围没有显著突变，进一步增加了其作为治疗靶点的价值[17]。

许多化合物已被报道对SARS-CoV-2 Mpro具有抑制作用。基于肽的SARS-CoV-2 Mpro抑制剂旨在模拟该酶的天然底物，通常带有与催化位点Cys145结合的共价头基[[18], [19], [20]]。例如，Jun9-62-2R（图1）对SARS-CoV-2 Mpro的抑制活性非常强，IC50值为0.43 μM[23]。尽管肽类抑制剂具有很大潜力，但它们也存在一些缺点，如反应性头基、药代动力学不佳（如代谢稳定性有限、膜通透性差以及口服生物利用度问题）。因此，人们致力于开发具有高活性且具有药物特性的非肽类抑制剂[[24], [25], [26]]。

非肽类化合物是一类重要的SARS-CoV-2 Mpro抑制剂，为肽类抑制剂提供了替代方案。这类化合物通常体积较小，化学结构与肽不同[27,28]。三取代哌嗪衍生物和螺吡唑并吡啶酮是非肽类Mpro抑制剂的代表性例子[29]。其他值得注意的非肽类抑制剂还包括α-酮酰胺类似物、白藜芦醇及其衍生物，以及重新开发的药物（如Tideglusib），后者在酶检测中用作阳性对照[30,31]。

异黄酮骨架在药物化学中具有广泛的应用，展现出多种生物活性[[32], [33], [34], [35], [36]]，尤其是其抗病毒活性。它成为设计SARS-CoV-2 Mpro抑制剂的有希望的起点。该骨架易于修饰，并且在多种天然来源中丰富，便于合成具有不同药理特性的衍生物。异黄酮核心能够与Mpro活性位点内的关键残基（如Cys145）形成氢键相互作用。异黄酮基团的N位取代可以改变其结构，从而改善药代动力学和药效学特性。

许多异黄酮衍生物已被证明能抑制Mpro。N位取代的异黄酮类似物I、II和III被证实为强效抑制剂，IC50值在纳摩尔范围内[37,38]。异黄酮-三唑杂化物IV和V显示出亚微摩尔级别的抑制活性，并显著降低了毒性，其中V对VERO-E6细胞的毒性完全消失[12,16]。另一类具有强抗病毒活性的异黄酮衍生物是含有双吲哚骨架的化合物。例如，化合物VI的双吲哚骨架是其低微摩尔抑制活性的主要原因，且几乎无细胞毒性[11]。从先前的结构-活性关系（SAR）研究可以推断，异黄酮骨架的C-5和N1位点的修饰对于发挥抑制作用至关重要。在N1位引入疏水基团可显著增强对Mpro的抑制效果。

受先前研究的启发，我们试图寻找具有与高效化合物Jun9-62-2R相似特性的非肽类化合物，以避免肽类分子常见的问题。为此，我们对几种已知的强效N位取代异黄酮化合物进行了基于形状的筛选，以探讨这些化合物与Jun9-62-2R之间的化学空间重叠程度。

如图2A所示，N位取代的异黄酮II和III的萘基和苯并噻吩基团与Jun9-62-2R的联苯基团具有显著的形状相似性。此外，异黄酮基团与吡啶基团占据相同的空间，并与相邻的3°N位和羰基功能团通过亚甲基相连。然而，二氯乙酰胺基团的其余原子并未在异黄酮衍生物中显示出相应的匹配性。因此，在N位取代的异黄酮衍生物中引入与二氯乙酰胺空间相似的基团是设计新型异黄酮连接Mpro抑制剂的有效策略。这些新化合物将保留高效N位取代异黄酮化合物的相互作用特性，同时具备与Jun9-62-2R相似的Mpro相互作用特性。

我们的研究最终使用乙基苯并呋喃-2-羧酸基团作为萘环和苯并噻吩环系统的替代物。值得注意的是，酯基团与二氯乙酰胺基团在空间上非常相似，其结构特性也相当（图2B）。

因此，我们设计并合成了11种苯并呋喃连接的N位取代异黄酮衍生物WD(a-k)，其中乙基酯基团来自苯并呋喃环。这11种化合物的主要区别在于异黄酮基团的取代类型和位置。通过光谱分析验证了这些化合物的结构。随后，在100 μM的浓度下对所有合成化合物进行了初步筛选，以选择抑制酶活性最高的化合物。选定的化合物通过多次浓度测定进一步确定了IC50值。进一步使用细胞毒性测定验证了这些化合物的安全性。最后，通过酶动力学和分子建模技术研究了这些异黄酮衍合物对Mpro的抑制机制。

化学部分

化学

苯并呋喃连接的N位取代异黄酮衍生物（WDa-k）按照方案1和方案2的方法合成。在干燥的甲苯中，乙基2-氯乙酰乙酸酯2与苯酚钠1发生亲核取代反应，生成乙基α-苯氧乙酰乙酸酯3。随后，将α-芳氧基β-酮酯与硫酸搅拌，进行环脱水反应，生成乙基3-甲基-2-苯并呋喃羧酸酯4。

结论

本研究鉴定了一系列新型N-（苯并呋喃-3-基甲基）异黄酮衍生物（WD-a-k）作为潜在的SARS-CoV-2 Mpro抑制剂。初步的FRET检测发现某些化合物具有显著的抑制活性，特别是在100 μM浓度下，WD-d、WD-f和WD-i的抑制效果最佳。后续测定的IC50值表明这些化合物在微摩尔范围内具有良好的抑制效果。

化学

熔点使用Stuart SMP10仪器测定，结果未经校正。核磁共振（NMR）在Bruker Avance III HD仪器上进行，1H NMR的频率为400 MHz，13C NMR的频率为101 MHz，溶剂为氘代DMSO-d6，内标为四甲基硅烷（TMS）。高分辨率质谱（HRMS）数据由Bruker MicroTOF谱仪获得。合成化合物的纯度超过95%。

作者贡献声明

瓦格迪·M·埃尔德赫纳（Wagdy M. Eldehna）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，验证，监督，概念构思。穆德夫库尔·伊斯兰·穆基姆（Md Sofequl Islam Mukim）：撰写 – 原稿，验证，方法学，形式分析。穆罕默德·M·埃尔德苏基（Mohamed M. Eldesouki）：验证，研究，数据管理。莫哈茂德·A·埃尔哈萨布（Mahmoud A. El Hassab）：撰写 – 原稿，可视化，验证，软件。雷汉·莫尼尔（Rehan Monir）：撰写 – 原稿，可视化，资金筹集，数据管理。穆罕默德·M·赫菲娜（Mohamed M. Hefina）：验证，方法学，形式分析。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者感谢国王哈立德大学（King Khalid University）研究与发展院通过小型研究项目（项目编号RGP1/212/46）资助了这项工作。此外，这项研究还得到了韩国科学技术院（KIST）的内部资助以及韩国科学技术大学（UST）的资助（项目编号2021YS16）。