《Analytica Chimica Acta》：Comprehensive Lipidomic Characterization of Human Blood by High-Throughput UHPSFC/MS using Bioinert Column and Modified MTBE Extraction
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针对超临界流体色谱（SFC）在离子型脂质分析中峰形差、灵敏度低的问题，本研究开发了一种结合生物惰性柱与改进无氯仿MTBE提取的高通量UHPSFC/MS方法，成功在人血中鉴定出657种脂质并定量239种，显著提升离子型脂质分析性能，为脂质组学提供了快速、准确且环保的新方案。
脂质是生命活动中不可或缺的分子，它们不仅是细胞膜的“砖瓦”和能量的“仓库”，还充当着信号“信使”的角色，调控着诸多生理过程。然而，脂质家族的成员数量庞大、结构多样，从非极性到高度极性的离子型脂质，其分析一直是个艰巨的挑战。传统的液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术虽然常用，但往往耗时耗溶剂，且对于含有磷酸基团等易与金属表面相互作用的离子型脂质（如磷脂酰丝氨酸PS、溶血磷脂酰丝氨酸LPS等），容易出现峰形拖尾、信号丢失等问题，这就像在精密的分子“指纹识别”中出现了模糊的“重影”，影响了检测的准确性和全面性。因此，开发一种能够快速、高效且精准覆盖全极性范围脂质的分析方法，对于揭示脂质在心血管疾病、糖尿病、癌症等重大疾病发生发展中的作用至关重要，也是临床脂质组学应用的迫切需求。
为了解决上述瓶颈，由Petra Peroutková、Robert Jirásko、Anna Taylor、Michal Hol?apek和Ond?ej Peterka组成的研究团队在《Analytica Chimica Acta》上发表了一项创新性研究。他们巧妙地借鉴了超临界流体色谱（SFC）分离速度快、效率高的优点，并将其与生物惰性技术相结合，同时优化了样本前处理流程，建立了一套全新的分析体系。
研究人员为开展此项研究，主要运用了以下几项关键技术方法：首先，他们使用了经过优化的甲基叔丁基醚（MTBE）液液萃取法，并增加了一步己烷去除步骤，从人血浆和富含红细胞的血样中提取脂质，这一改进旨在高效提取极性脂质的同时减少非极性脂质（如甘油三酯TG）的浓度。其次，分析核心采用超高效超临界流体色谱-质谱联用（UHPSFC/MS）技术，关键创新点在于使用了原本为亲水相互作用色谱（HILIC）设计的生物惰性色谱柱（Acquity Premier BEH HILIC柱），以超临界二氧化碳（scCO2）和含30 mM醋酸铵的甲醇（含1%水）作为流动相进行梯度洗脱。质谱检测则在正、负离子模式下进行。此外，研究遵循生物分析方法验证指南，对方法进行了全面验证，并最终使用标准参考物质NIST SRM 1950人血浆进行定量分析以确认准确性。数据处理则借助了LipidQuant软件进行半自动化的脂质鉴定与定量。
3.1. UHPSFC/MS方法的优化
通过对比生物惰性柱和传统不锈钢柱对脂质标准品的分离效果，研究人员得出结论：生物惰性柱能显著改善PS、LPS、磷脂酸（PA）、溶血磷脂酸（LPA）、磷酸神经酰胺（CerP）和鞘氨醇碱基磷酸酯（SPBP）等离子型脂质类的峰形。经过对流动相梯度、补充液流速及质谱离子源参数的优化，最终建立了总运行时间仅7.5分钟（包括柱平衡）的高通量方法。该方法还能分离某些同分异构体，如葡萄糖神经酰胺（GlcCer）与半乳糖神经酰胺（GalCer）。
3.2. 提取程序的优化
研究人员系统比较了包括Folch、Bligh-Dyer、MTBE以及蛋白沉淀（BuMe）在内的多种脂质提取方法。结果表明，经过优化的、使用pH 5的250 mM碳酸铵水相的双相MTBE提取法，对绝大多数脂质类别都表现出高且稳定的提取回收率。特别增加的己烷去除步骤，有效降低了样品中高丰度非极性脂质（TG、胆固醇酯CE）的浓度，从而允许注入更浓缩的脂质提取物，同时减少了质谱离子源的污染。
3.3. 人血中脂质的鉴定
将优化后的方法应用于人血浆和富含红细胞组分的非靶向分析，通过结合精确质量数、脂质类别标准品保留时间确认以及保留行为依赖性，实现了高可信度的脂质鉴定。最终，在人血中共鉴定出657种脂质，归属于37个脂质亚类，其中在血浆中鉴定出477种，在富含红细胞组分中鉴定出575种。与实验室内部及不同实验室间已有的UHPSFC/MS或HILIC/MS方法相比，本方法在更短的分析时间内实现了更多脂质种类的鉴定。
3.4. 人血浆的方法验证
该方法按照生物分析方法验证的建议进行了全面验证。使用69种内标涵盖了37个脂质亚类。验证结果显示，所有内标的校准曲线线性良好，准确度、精密度、选择性、仪器精密度等参数均符合要求。提取回收率评估证实，除经过设计的非极性脂质回收率较低外，其余脂质类别的回收率均在可接受范围内。
3.5. NIST SRM 1950的定量分析
应用已验证的方法对标准参考物质NIST SRM 1950人血浆进行定量分析，共定量了239种脂质。将测定浓度与已有的多个实验室间环试结果进行对比，显示出高度相关性，从而确认了该定量方法的准确性。尽管本方法采用脂质类别分离策略（确保内标与待测物共流出），而环试多采用脂质种类分离策略，且使用的内标组成不同，但结果的一致性证明了本方法的可靠性。
本研究成功开发并验证了一种结合生物惰性色谱柱与改进MTBE提取的高通量UHPSFC/MS脂质组学分析方法。该方法的核心贡献和创新意义在于：第一，首次在SFC平台上应用生物惰性柱，彻底解决了离子型脂质因与金属表面相互作用导致的峰形差和灵敏度低这一长期存在的技术难题，为磷酸酯类等“棘手”脂质的分析提供了强大工具。第二，通过优化提取流程，在保证极性/离子型脂质高回收率的前提下，巧妙降低了非极性脂质的浓度，提升了方法耐受性和离子源清洁度，使得连续分析样本量大幅增加。第三，该方法在短短7.5分钟内即可实现从非极性到离子型脂质的宽极性范围分离，并鉴定出多达657种人血脂质，其分析通量和覆盖面超越了先前多数方法。第四，整个方法体系（包括低溶剂消耗的SFC、无氯仿提取）更符合绿色化学原则，并且经过严格验证，定量结果与权威标准物质参考值吻合，具备了应用于临床大规模样本精准脂质组学分析的潜力。这项研究不仅为脂质组学研究提供了一种快速、全面且准确的新技术方案，也展示了生物惰性组件在扩展SFC技术应用边界方面的巨大潜力，有望推动其在生物医学研究和疾病生物标志物发现中的更广泛应用。
