《PLOS One》：Physiological and biochemical characterization of trypsin from Neocaridina denticulata sinensis and its roles in ontogenesis and immune response
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本文系统地研究了中华锯齿新米虾（Neocaridina denticulata sinensis）胰蛋白酶基因（NdTryp）的分子特征、表达模式及其生理功能。研究表明，NdTryp在肝胰腺中高表达，在胚胎后期（孵化与开始摄食阶段）表达急剧升高，并能在副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）感染后被诱导上调。RNA干扰（RNAi）敲低 NdTryp会加剧感染后肝胰腺损伤（包括上皮脱落与基底膜破坏）。生化分析显示，重组 NdTryp（rNdTryp）在宽温宽pH范围内均具有高蛋白酶活性，其活性受金属离子调节（二价阳离子增强，三价铁抑制）。本研究首次揭示了 NdTryp 在甲壳动物晚期胚胎发育与固有抗菌防御中的多重作用，并凸显了其在饲料添加剂与酶法生物转化中的潜在应用价值。
1. Introduction
胰蛋白酶是甲壳动物体内一种典型的丝氨酸蛋白酶，在蛋白质降解、消化、胚胎发育和免疫防御中发挥关键作用。在全球水产养殖业中，虾类是具有重要经济价值的产品。一方面，副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是常见的甲壳动物病原体，可引起急性肝胰腺坏死综合征，造成严重的经济损失；另一方面，虾类捕捞后的货架期常因胰蛋白酶催化的肌肉组织降解而受到限制。中华锯齿新米虾（Neocaridina denticulata sinensis）因其繁殖率高、生命周期短、饲养简单等优点，常被用作生理与生态学研究的模式动物。然而，目前对该虾中胰蛋白酶（NdTryp）的基本信息知之甚少，包括其全长基因序列、组织表达谱、发育动态、抗菌防御中的功能以及金属离子敏感性等生化性质。因此，本研究以中华锯齿新米虾为模型，旨在全面解析其胰蛋白酶基因（NdTryp）的结构特征、表达模式与功能，并探讨其潜在的工业应用价值。
2. Materials and methods
2.1. Experimental animals
健康虾样本来自中国河北省保定市安新县的当地市场。实验前，虾在循环水族箱中驯化7天，水温保持在25±1°C，光暗周期为12:12小时。
2.2. Gene cloning
胰蛋白酶基因序列从已发表的全长转录组中鉴定，并设计基因特异性引物。通过PCR扩增获得全长cDNA，连接至pMD19-T载体后转化DH5α感受态细胞进行测序。
2.3. Bioinformatics analysis of NdTryp
利用NCBI BLAST分析全长cDNA序列，预测功能位点与理论等电点（pI）。通过SMART进行蛋白结构域分析，并用MEGA 7.0构建系统发育树。使用SWISS-MODEL在线服务器预测蛋白质三维结构。
2.4. Methodology of RNA interference (RNAi)
设计靶向NdTrypORF的引物合成双链RNA，采用dsNdTryp注射进行基因敲低，dsEGFP作为阴性对照。
2.5. Experimental challenge with V. parahaemolyticus
使用携带毒力基因PirAVP和PirBVP的副溶血弧菌菌株进行感染实验。将细菌浓度调整为1×106CFU/mL后，对虾进行注射。
2.6. Quantitative real-time PCR (qPCR) assay
收集虾的不同组织（肠道、肌肉、卵巢、鳃、表皮、精巢、胃、心脏、眼柄、肝胰腺和腹神经）及不同胚胎发育阶段的样本，提取总RNA并逆转录为cDNA。以18S核糖体RNA为内参，通过qPCR分析NdTryp的表达谱。
2.7. Methodology of hematoxylin-eosin (H&E) staining
取肝胰腺组织固定、脱水、石蜡包埋后切片，进行H&E染色以观察组织形态。
2.8. In situ hybridization (ISH) of NdTryp mRNA-expressing cells
采用原位杂交技术定位NdTrypmRNA在肝胰腺中的细胞表达。
2.9. Prokaryotic expression, purification, and enzymatic activity assay of recombinant NdTryp (rNdTryp)
构建pCT7-CHISP6H-NdTryp表达载体，转化至BL21-Star(DE3) pLysS感受态细胞中进行原核表达，通过Ni2+-NTA柱亲和层析纯化蛋白，并测定其酶活。
2.10. Biochemical characterization of rNdTryp
评估rNdTryp在不同温度、pH及金属离子条件下的酶活性。
2.11. Statistical analysis
数据以均值±标准差表示，采用SPSS进行统计分析，多组比较使用单因素ANOVA，两两比较采用t检验。
3. Results
3.1. Characteristics of the NdTryp gene and its deduced amino acid (aa) in N. denticulata sinensis
NdTryp的全长cDNA为906 bp，包含801 bp的开放阅读框，编码266个氨基酸，预测pI为4.26。该蛋白含有一个Tryp_SPc结构域，具有三个活性位点（His 74、Asp 125和Ser 218）和钙离子结合位点（Asp 185、Asp 199、Met 201、Glu 253）。系统发育分析显示NdTryp属于软甲纲的胰蛋白酶分支。
3.2. qPCR analysis of the distribution of NdTryp in different tissues and during shrimp ontogenesis
NdTryp在所有测试组织中均有表达，其中肝胰腺中表达量最高（约76533.5倍），其次是精巢。在胚胎发育过程中，早期胚胎阶段（囊胚期、卵裂期、原肠期、前无节幼体期和后无节幼体期）未检测到表达；在眼点色素形成前期开始出现表达，并在眼点色素形成后期、溞状幼体期及幼体期急剧升高并维持在较高水平。
3.3. Response of NdTryp mRNA expression under V. parahaemolyticus challenge
感染副溶血弧菌后，NdTryp的表达呈时间依赖性上调，在24 h达到峰值，约为0 h的3倍。敲低NdTryp后进行细菌攻击，可导致肝胰腺组织出现部分坏死、上皮细胞（ECT）与储存细胞（R-cell）脱离基底膜，以及基底膜局部破裂等严重病理损伤。
3.4. Localization of NdTryp mRNA expression in hepatopancreas
原位杂交结果表明NdTrypmRNA主要定位于肝胰腺的储存细胞（R-cells）和管腔上皮细胞（ECTs），而在分泌细胞（B-cells）中未检测到信号。
3.5. Purification of rNdTryp and detection of enzymatic activity
SDS-PAGE显示纯化的rNdTryp为单一条带，分子量约35 kDa，酶活测定为233.78 ± 4.07 U/mL。
3.6. Enzymatic characterizations of rNdTryp
rNdTryp的最适pH约为8.0，在碱性范围内保持高活性，但在酸性条件下迅速失活。最适温度为35°C，60°C时活性显著下降（相对活性约7.18%）。在金属离子影响方面，Cd2+、Cu2+、Mn2+能显著增强酶活，而K+、Mg2+、Fe3+则表现出抑制作用，其中Fe3+抑制约71%。
4. Discussion
4.1. Structural features and evolutionary conservation of NdTryp
NdTryp的催化三联体为His 74、Asp 125、Ser 218，与已报道的典型胰蛋白酶结构略有差异。其三维模型显示两个β-桶状结构域堆叠，催化残基位于其交界处，这种结构有助于维持酶的稳定性。
4.2. NdTrypexpression and its biological significance
NdTryp在肝胰腺中的高表达与该器官的消化与免疫功能相吻合。其在胚胎后期的高表达可能为孵化及自主摄食提供必要的消化酶。此外，胰蛋白酶还可能通过切割蛋白酶激活受体2（PAR-2）参与细胞信号传导。
4.3. Proposed immune mechanisms
肝胰腺是虾类重要的免疫器官。NdTryp在副溶血弧菌感染后表达上调，其敲低导致肝胰腺坏死加剧，提示其可能在免疫防御中发挥重要作用。可能的机制包括作为转化酶激活抗菌肽前体，或参与酚氧化酶原（proPO）系统的激活，进而促进黑色素形成以限制病原体扩散。
4.4. Biochemical properties and biotechnological potential
rNdTryp在较宽的温度与pH范围内保持高活性，并受多种金属离子调节。其在工业上具有潜在应用价值，例如作为水产饲料添加剂以提高养分消化率，或作为食品废弃物降解的生物催化剂。
5. Conclusions
本研究首次报道了中华锯齿新米虾胰蛋白酶（NdTryp）的全长cDNA序列。NdTryp在肝胰腺中表达最高，主要定位于R-cells和ECTs。其在胚胎早期不表达，但在后期急剧上升。感染副溶血弧菌可诱导其表达上调，而敲低表达则会削弱虾的抗感染能力，导致肝胰腺损伤。重组NdTryp（rNdTryp）展现出宽温宽pH的蛋白酶活性，提示其作为饲料添加剂或生物催化剂的潜力。综上所述，NdTryp在中华锯齿新米虾的胚胎发育与抗菌防御中扮演关键角色，其良好的酶学性质为其工业应用奠定了基础。
