《Environmental Pollution》：ERα-mediated endoplasmic reticulum stress drives 4-tert-octylphenol–induced cardiac developmental toxicity in zebrafish
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本研究发现，4-tert-辛基酚通过激活ERα引发内质网应激，导致心肌细胞凋亡，进而造成斑马鱼胚胎心脏发育畸形。ERα特异性抑制剂可逆转此效应，证实ERα-ERS-凋亡轴是环境雌激素诱导心脏发育毒性的关键通路。
Jin Chen|Mingxue Gong|Jing Fu|Yan Liu|Jingwei Lei|Ruixi Liu|Mengqin Wu|Ying Lei|Anfei Liu|Tao Jing|Zhenzhong Liu
四川北川医学院公共卫生学院，中国四川南充637100
摘要
4-叔丁基酚（4-t-OP）是一种广泛存在于环境中的雌激素，但其对心脏的发育毒性及其潜在机制尚未完全明了。本研究利用斑马鱼胚胎探讨了雌激素受体（ER）介导的内质网应激（ERS）是否参与了4-t-OP诱导的心脏畸形。发育过程中暴露于4-t-OP显著增加了心脏异常的发生率，同时伴有心包水肿和心率下降。机制上，4-t-OP激活了ER信号通路，表现为ER蛋白水平升高以及ER响应基因的转录失调，这些效应可通过ER拮抗剂ICI 182780得到抑制。基因特异性敲低实验表明，ERα（esr1）而非ERβ（esr2a）是4-t-OP诱导的心脏毒性的关键介质。转录组学和分子分析显示，4-t-OP暴露后ERS和凋亡通路被显著激活。ERα的激活通过上调ER应激标志物C/EBP同源蛋白（CHOP）和蛋白质二硫键异构酶（PDI）的表达来体现，进而导致心肌细胞过度凋亡。值得注意的是，通过4-苯丁酸药理学抑制ERS显著减轻了心脏畸形和凋亡。这些发现表明，异常的ERα激活将环境雌激素暴露与ERS驱动的心肌细胞凋亡联系起来，从而干扰心脏发育。
引言
4-叔丁基酚（4-t-OP）是烷基酚类化合物（APs）的重要衍生物，是一种具有雌激素活性的环境内分泌干扰物（EDC）（Janicki等人，2016年）。它广泛应用于表面活性剂、增塑剂和农药制剂等工业产品中（Gu等人，2021年；Janousek等人，2020年）。监测数据显示，中国太湖表面水中的4-t-OP浓度高达104.7 ng/L（Liu等人，2016年）。由于其高脂溶性、环境持久性和抗降解性，4-t-OP可在水环境中持续存在数月至数年，并具有强烈的生物累积潜力（Shi等人，2022年）。人类可能通过多种途径暴露于该物质，包括饮用水、受污染的食物、吸入和皮肤接触。值得注意的是，已在人类血清（最高134.4 μg/L）和母乳中检测到4-t-OP，这突显了其广泛的存在及其潜在的健康影响（Gao等人，2023年；Graca等人，2016年）。
作为强效的EDC，4-t-OP能与雌激素受体（ERs）结合，破坏内分泌稳态，从而影响生殖、神经和免疫系统（Bian等人，2006年；Bianco等人，2011年；Chen等人，2024年；Maciuszek等人，2020年；Sheikh等人，2020年；Yang等人，2020年）。流行病学研究表明，母亲体内4-t-OP水平升高与不良妊娠结局相关，包括胎儿生长受限和早产（Jiang等人，2022年；Long等人，2024年）。胚胎发育对EDC暴露特别敏感，动物实验表明4-t-OP可引发多种发育异常，如鱼类卵黄蛋白合成异常、啮齿动物Leydig细胞凋亡以及小鼠着床失败（An等人，2013年；Chen等人，2022年；Tran等人，2018年）。我们的先前研究也显示，4-t-OP暴露会导致斑马鱼胚胎出现明显的心脏发育缺陷（Wang等人，2025年），但其潜在的分子机制仍不明确。
研究表明，4-t-OP可上调ER表达并增强ER信号活性，对ERα和ERβ亚型的结合亲和力相当（Romano等人，2017年）。ERα在心脏形态发生、心肌细胞分化和心管形成中起关键作用（Aryan等人，2020年；Paris等人，2002年）。异常的ERα激活会干扰心脏循环和心肌发育，提示ERα可能是EDC诱导的心脏毒性的关键上游介质（Liu等人，2024年）。尽管有证据表明4-t-OP同时激活ERα和ERβ，但各ER亚型在心脏发育中的具体作用，尤其是在体内，仍不清楚。
持续的ERα激活会破坏细胞内蛋白质稳态，从而引发内质网应激（ERS）（Adegoke等人，2023年；Xu等人，2022年）。虽然ERS最初是一种恢复蛋白质折叠能力的适应性反应，但长期或过度的ERS会通过C/EBP同源蛋白（CHOP）-半胱天冬酶-3轴促进凋亡（Hetz和Papa，2018年；Wu等人，2021年）。我们的先前研究表明，ERS触发的凋亡是斑马鱼心脏畸形的关键机制（Zhang等人，2022年）。类似地，双酚A等ERα激动剂也通过ERS依赖的凋亡途径诱导胚胎心脏缺陷（Hu等人，2018年；Zhang等人，2022年）。然而，4-t-OP是否通过ERα依赖的ERS-凋亡轴诱导心脏发育毒性仍有待确定。
基于这些观察，我们假设4-t-OP选择性地激活ERα（esr1），导致持续的ERS和随后的半胱天冬酶依赖性凋亡，最终导致斑马鱼胚胎的心脏畸形。为了验证这一假设，我们采用了一种综合策略，结合分子对接、基因敲低、药理学干预和表型分析来系统解析ERα–ERS–凋亡信号通路。本研究旨在揭示环境雌激素诱导的心脏发育毒性的分子机制，并确定与环境风险评估相关的潜在早期分子指标。
化学试剂
4-t-OP（CAS编号：140-66-9，纯度：97.5%）标准品购自AccuStandard（美国康涅狄格州纽黑文）。同位素标记的内标13C6-BuP购自中国上海的Shanghai Anspet Technology Co., Ltd.（目录编号CDDM-B693603）。实验中使用的其他化学试剂如下：ICI182780（CAS编号：129453-61-8，纯度：97.6%，MedChemExpress，中国），4-PBA（CAS编号：1821-12-1，纯度：99.76%，TargetMol，中国），Ac-DEVD-CHO（CAS编号：
ER介导4-t-OP在斑马鱼胚胎中诱导的心脏畸形
为确定ERs在4-t-OP诱导的心脏畸形中的作用，我们首先评估了ER拮抗剂ICI182780（ICI；0–640 nM）的剂量依赖性效应。如图1A–C所示，浓度在10至40 nM范围内的ICI显著降低了4-t-OP诱导的心脏畸形发生率（p < 0.05）。值得注意的是，40 nM的ICI几乎完全恢复了心脏形态至对照组水平（图1B），且不影响胚胎存活（图1C）。相比之下，
讨论
4-叔丁基酚（4-t-OP）是一种广泛存在于环境中的烷基酚类内分泌干扰物，其潜在的发育毒性近年来受到越来越多的关注（Morthorst等人，2016年；Xia等人，2022年）。流行病学调查发现，中国东部农村居民血浆中的4-t-OP浓度高达134.4 μg/L（Gao等人，2023年），表明人类暴露于该化合物的情况不容忽视。
结论
本研究阐明了4-t-OP在斑马鱼胚胎中诱导心脏发育毒性的分子机制。我们发现4-t-OP异常激活ERα/esr1，导致持续的ERS和随后的心肌细胞凋亡，最终引发心脏畸形。这些发现确定了ERα作为关键的上游靶点，并建立了ERα–ERS–凋亡轴，将其作为环境雌激素暴露与心脏发育紊乱之间的关键通路。
作者贡献声明
Ying Lei：研究工作。Anfei Liu：监督、资金获取。Ruxi Liu：研究、数据管理。Mengqin Wu：研究、数据管理。Yan Liu：研究。Jingwei Lei：研究。Jing Fu：研究。Jin Chen：撰写初稿、研究、资金获取。Mingxue Gong：撰写初稿、研究。Tao Jing：监督、资金获取。Zhenzhong Liu：监督、项目管理
利益冲突声明
作者声明没有已知的利益冲突或可能影响本文工作的个人关系。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（22076054，资助给T.J.）、四川省自然科学基金（2026NSFSC0253，资助给C.J.；2026NSFSC1798，资助给L.A.）、北川医学院博士研究基金项目（CBY23-QDA12，资助给C.J.；CBY23-QDA13，资助给L.A.）以及大学生创新创业培训计划项目（S202510634063，资助给L.J.；S202510634055，资助给L.Y.）的财政支持。
