《Environmental Research》：Mobile Genetic Elements Drive the Assembly of High-Risk Resistance and Virulence Configurations at the Riverine Water–Sediment Interface
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农村至城市梯度河流中水体与沉积物中抗生素抗性基因（ARGs）、重金属抗性基因（MRGs）、毒力因子（VFs）及可移动遗传元件（MGEs）的分布特征、移动机制及协同作用研究。通过枪式宏基因组测序与污染物指纹分析，发现ARGs和MRGs丰度及多样性随梯度变化显著，且ARG-MGE共定位在城市化区域沉积物中形成多抗性基因网络。源追踪与PLS路径模型表明，农村沉积物是主要风险基因来源，而城市沉积物中MGEs通过整合多类风险基因形成持久性基因载体，驱动河流生态系统多污染协同效应。
Jingru Yang|Xin Meng|Hongzheng Zhang|Wanchen Sun|Linzhen Yang|Simin Li
河北工程大学能源与环境工程学院，河北污水处理与资源化工程研究中心，邯郸056038，中国
摘要
河流生态系统是微塑料、重金属和抗生素的主要传输和储存场所，但这些共同存在的压力因素如何共同影响水和沉积物中的抗性及毒力风险仍不清楚。在本研究中，我们结合了霰弹枪宏基因组学和沿代表性农村-城市梯度的污染物分析，在干旱季节研究了抗生素抗性基因（ARGs）、金属抗性基因（MRGs）、毒力因子（VFs）和移动遗传元件（MGEs）在配对的地表水和表层沉积物中的分布、迁移性和驱动因素。细菌群落主要由假单胞菌门（Pseudomonadota）和放线菌门（Actinomycetota）主导，而真菌群落则主要由子囊菌门（Ascomycota）和尿病毒门（Uroviricota）主导，且土地利用对水体的影响比对沉积物的影响更显著。在所有样本中，我们检测到了36类ARG和1,589个亚型，其中多重耐药性和外排机制或靶点改变机制占主导。此外，从农村到城市地区，ARG的丰富度、丰度和多样性在两种介质中均有所增加。MGEs主要由转座酶（transposases）主导，而在1,474个contigs上发现的ARG-MGE共定位现象揭示了城市沉积物中以转座酶为中心的密集网络，这些网络关联了多重耐药性、肽类、糖肽类和四环素抗性。重要的是，我们确定了同时携带ARGs、MRGs和VFs的contigs作为多性状风险基因的载体。城市地区拥有多样化的载体谱系，而农村地区则主要由特定载体的高丰度主导。SourceTracker和偏最小二乘路径模型共同表明，农村沉积物是微生物和风险基因的主要上游来源，而城市沉积物中的MGEs将多重污染压力转化为更大规模且更具迁移性的风险基因库。这些发现强调了在多重压力条件下共同管理农业投入和城市沉积物的必要性。
引言
河流生态系统是人为污染物的主要传输和储存场所，包括微塑料（MPs）、重金属和抗生素——尤其是在城市化和工业化加速的背景下[1]。除了它们的直接生态毒性效应[2]外，这些压力因素的共同存在还会产生复杂的选择机制，从而放大环境风险基因，包括抗生素抗性基因（ARGs）、金属抗性基因（MRGs）和毒力因子（VFs）[3]。越来越多的证据表明，这种多重污染环境不仅增加了单个风险基因的丰度，还重构了底层的微生物群落，进而影响基因的迁移性、宿主范围以及有害性状在陆地-河流-海岸连续体中的持久性[4]。尽管大多数研究和政策都集中在抗生素抗性上，但越来越多的观察表明，抗性很少单独作用，而是经常与毒力潜力和环境耐受性相互作用，可能在人类-环境界面加剧健康风险[5]。
在此背景下，我们将风险基因定义为ARGs、MRGs和VFs的三重组合。这些元素在同一遗传背景下的共存代表了环境和公共卫生的复合危害。这些污染物创造了一个复杂的选择环境，促进了风险基因的增殖。重金属可以通过共享的遗传和生理机制共同选择抗生素抗性[6]。微塑料为生物膜的形成提供了新的表面，形成了一个塑料球（plastosphere），通过集中微生物和移动遗传元件（MGEs）成为水平基因转移（HGT）的热点[7]。即使是亚抑制浓度的抗生素也能进一步刺激这种基因交换[8]，从而形成了一个反馈循环，使得擅长获取和传播风险基因的微生物群落得到富集[9]。
这种共同选择压力不仅限于抗性，因为VFs也需要特别考虑。VFs可以与ARGs和MRGs在同一MGEs上共定位，它们的表达通常也受到共同调控[10]、[11]、[12]。这些性状的共同选择尤其令人担忧，因为它可以产生同时具有更强毒力和更难治疗的多性状抗性谱系，这对公共健康构成了双重威胁，需要综合评估ARGs、MRGs和VFs，而不仅仅是孤立地研究它们[5]。尽管这些污染物经常共存，但关键的机制性差距仍然存在[13]。大多数先前的研究依赖于统计相关性来推断风险基因和MGEs之间的关系[14]、[15]、[16]。然而，相关性并不意味着因果关系或物理相互作用[17]、[18]。重要的是，很少有研究超越基于丰度的相关性，来证明ARGs、MRGs和VFs在同一染色体或质粒片段（contigs）上的物理遗传联系[19]、[20]、[21]。解决这种物理共定位对于确认共同选择和水平转移的潜力至关重要，但在河流沉积物-水界面这一领域，这方面的量化仍然不足[6]、[22]、[23]。
为了填补这些空白，并与以往基于扩增子的调查不同（这些调查只是关联不同的群落和抗性谱型），本研究利用霰弹枪宏基因组学组装来解析风险基因和移动元件之间的物理遗传联系。这种方法允许对携带共定位风险基因的contigs进行分类，并确定驱动传播的具体移动载体（例如Tn3转座子），从而提供了超越简单丰度相关的风险传播机制理解。具体来说，我们在从内陆湖泊出口到河口的河流走廊中采集了配对的水和沉积物样本。我们量化了两种介质中的MPs，并表征了沉积物中的抗生素和重金属，以建立共暴露基线。然后我们解析了ARGs、MRGs、VFs和MGEs的组成和丰度，并通过contig级别的共定位评估了基因的迁移性。最后，我们应用多元变量和路径建模方法来识别关键的环境和微生物驱动因素，并推断不同区域之间的差异机制[24]。我们的目标是在干旱季节研究一个具有代表性的流域，以捕捉低水文稀释条件下的基线污染风险：（1）解析MPs、重金属、抗生素及相关风险基因（ARGs、MRGs和VFs）沿农村-城市梯度的分布情况，以及这两种介质之间的差异；（2）通过绘制contigs上ARGs、MRGs、VFs和MGEs的共定位图，并利用源追踪方法追踪农村和城市对下游沉积物的贡献，来识别多性状风险基因的配置和潜在载体；（3）量化MGEs如何将风险基因从多样化的上游来源驱动到下游城市沉积物中积累的多性状风险基因载体组合。通过整合污染物、微生物组和基因迁移性在水质-沉积物和农村-城市维度上的信息，本研究为诊断多性状风险基因载体和预测多重污染压力如何沿河流网络传播抗性和毒力提供了框架。
研究区域和样本收集
本研究在白洋淀湖出口到海洋河口的Daqing河流域进行（38°44′–38°59′N, 115°45′–116°07′E）。研究区域长度约为140公里，相邻站点之间的距离从3公里到18公里不等，以确保采样点之间的空间独立性。该地区具有温暖温带大陆性季风气候，其土地利用从上游到下游呈现出从集约化农业
水和沉积物微生物组的分类组成
在所有样本中，宏基因组测序产生了来自15个水样的8.43亿个原始读段和来自15个沉积物样本的6.88亿个原始读段，相当于104万个非冗余基因（表S2）。其中，94万个基因被归类为细菌，3.99万个归类为真菌，5197个归类为病毒。细菌群落主要由假单胞菌门（Pseudomonadota）、放线菌门（Actinomycetota）、绿弯菌门（Chloroflexota）和疣微菌门（Verrucomicrobiota）主导，这些菌门合计占细菌总相对丰度的约70%（44%、15%、5%和6%）
沿农村-城市梯度的微生物群落差异
在该河流流域中，细菌群落主要由假单胞菌门（Pseudomonadota）、放线菌门（Actinomycetota）、绿弯菌门（Chloroflexota）和疣微菌门（Verrucomicrobiota）主导，同时还有真菌（主要是子囊菌门（Ascomycota）和病毒（主要是尿病毒门（Uroviricota））（图2a；图S1）。沉积物组合表现出更高的空间同质性，但农村和城市区域之间的对比度低于水柱群落（图2b；图S2）。相比之下，水中的微生物组成在上游农村和下游城市之间有显著差异
结论
本研究表明，河流生态系统中的抗生素抗性并非局部现象，而是由上游累积输入和MGE驱动的遗传整合的协同效应引起的。我们证明，虽然水柱对局部城市化反应迅速，但沉积物作为长期储存库，保留了污染特征，并促进了多性状风险基因组合的组装。
CRediT作者贡献声明
Linzhen Yang：研究。Wanchen Sun：研究。Jingru Yang：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、可视化、软件、方法学、数据分析、概念化。Hongzheng Zhang：软件、研究。Xin Meng：撰写——审稿与编辑、资源获取、项目管理、资金获取、概念化。Simin Li：监督、资金获取
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了河北省自然科学基金（项目编号B2025402028）和中央指导地方科技发展基金项目（河北省科技厅项目）（项目编号236Z3603G）的支持。
