《Journal of Power Sources》：Mediated electron transfer in the bio-reduction of graphene oxide by
Lysinibacillus sphaericus: Mechanisms and facilitation
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微生物还原石墨烯氧化物通过直接细胞色素介导和黄素依赖双机制，基因组测序揭示完整呼吸链与黄素合成途径，代谢组学证实GO胁迫下黄素及芳香氨基酸代谢富集，qRT-PCR验证关键电子传递基因上调，控制实验排除非生物还原。
Jinyang Chen|Xiaoyu Lin|Wei Wang|Li Gan|Zuliang Chen
福建省师范大学环境与资源科学学院，污染控制与资源再利用重点实验室，中国福建省福州市350117
摘要
微生物还原氧化石墨烯（GO）是一种生产功能性纳米材料的可持续方法，但其在革兰氏阳性细菌中的机制仍不甚明了。在本研究中，发现Lysinibacillus sphaericus HJ-3可以通过直接的细胞色素介导的电子转移和黄素依赖的穿梭作用有效还原GO。全基因组测序揭示了完整的呼吸链和黄素生物合成途径，而代谢组学分析表明在GO胁迫下核黄素和芳香氨基酸代谢增强。qRT-PCR分析进一步证实了在GO还原过程中关键电子转移基因（尤其是c型细胞色素）的上调。包括非生物因素、热灭活菌株和非还原性革兰氏阳性菌株在内的对照实验验证了这一过程是真正的生物活性。这些发现为L. sphaericus中GO还原的细胞外电子转移机制提供了多组学证据，并突显了其对氧化还原胁迫的适应性反应。重要的是，该研究表明内源性黄素作为高效的电子穿梭载体，促进了GO的微生物还原。这项工作不仅加深了对革兰氏阳性细菌细胞外电子转移的理解，还强调了微生物策略作为先进石墨烯基材料的绿色和可扩展方法的潜力。
引言
石墨烯是一种二维结构的碳纳米材料，具有卓越的电学、机械和光学性能，以及无与伦比的化学特性和物理结构[1,2]。特别值得关注的是还原氧化石墨烯（rGO），它因在还原过程中氧含功能团的部分还原而具有优异的性能[3,4]。rGO的独特属性，如高电导率、大比表面积和优异的机械柔韧性，使其成为先进储能系统（包括锂离子电池、超级电容器和钠离子电池）的理想候选材料。在这些应用中，基于rGO的材料的高电导率促进了电子传输，而其大表面积则提高了电容和能量密度[5]。然而，现有的还原方法存在某些局限性：低产量的物理还原方法不适合大规模应用，而化学还原方法则会产生二次污染[1]。
为应对这些限制，迫切需要创新技术，既能减轻污染又能实现rGO的大规模生产。已经探索了多种环保试剂，包括蛋白质、柠檬酸钠、没食子酸、茶多酚、维生素C和褪黑素等，作为GO还原的替代方案，这些方法经济高效且操作简便[6]。值得注意的是，微生物还原方法利用了微生物的高还原潜力，并利用微生物分泌物作为稳定剂来改性石墨烯基材料[7]。尽管已有研究探讨了微生物对GO的还原，尤其是利用专门的厌氧呼吸细菌如革兰氏阴性菌Shewanella sp. [8,9]，但现有研究主要集中在评估微生物还原GO的有效性，例如Shewanella baltica 10735和Shewanella oneidensis MR-1表现出良好的结果[8]。同样，Escherichia coli和Azotobacter chroococcum也成功还原了GO中的氧含功能团[8,10]。然而，关于使用革兰氏阳性细菌进行GO还原的研究仍然有限，尤其是涉及革兰氏阳性细菌的机制尚不清楚[11]。因此，文献中存在一个关键空白，亟需系统探索革兰氏阳性细菌介导的GO还原机制。相关机制需要得到阐明。
使用革兰氏阳性细菌生产rGO的可能机制是什么？微生物介导的细胞外还原过程主要依赖于细菌呼吸代谢过程中产生的电子通过微生物电子传输系统的转移[9]。革兰氏阳性细菌的电子转移优势在于其结构较为简单，与革兰氏阴性细菌复杂的跨膜电子传输过程相比，电子流只需穿过内膜、周质空间然后穿过外膜[12]。微生物细胞外电子转移介质（ETM）在电子从微生物呼吸链传递到细胞外电子受体（尤其是难以扩散的固体）的过程中起着关键作用[13]。这有助于还原不溶性水滑石和氧化石墨烯等大分子。通常，微生物向细胞外受体的电子转移包括直接接触和间接接触[14]。最近的研究表明，某些具有氧化还原能力的可溶性物质（如钴胺素、亚甲蓝和中性红）可以作为ETM[15]。然而，由于革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖组成[12]，其生物电化学活性有限。因此，添加ETM已被证明可以有效增强微生物介导的电子转移过程，从而提高整个系统的电子转移效率[16]。
研究人员对革兰氏阳性细菌中的细胞外电子转移主要途径进行了讨论，但关于Lysinibacillus sphaericus HJ-3还原氧化石墨烯（GO）的详细机制研究仍然较少。据推测，L. sphaericus HJ-3能够有效将GO还原为还原石墨烯（rGO）。鉴于许多革兰氏阳性细菌的固有电活性较弱，本研究还探讨了通过添加外源性电子转移介质（ETMs）来提高L. sphaericus HJ-3的细胞外电子转移效率。因此，本研究解决了几个关键问题：筛选出的L. sphaericus HJ-3的遗传和功能特性；其在将GO还原为rGO方面的有效性；其内在的电子生成能力；相关的电子转移和还原途径；以及提高还原性能的策略。
为系统回答这些问题，采用了多种方法。首先，通过16S rRNA测序鉴定出L. sphaericus HJ-3，并进行了全基因组测序，发现了与电子转移和黄素生物合成相关的基因。对其生理和生化特性进行了全面表征，以确定其作为生物还原剂的潜力。其次，使用XRD和拉曼光谱评估了L. sphaericus HJ-3对GO的脱氧能力，并通过包括非生物对照、热灭活细胞和非还原性菌株在内的严格对照实验确认了还原的生物学来源。第三，进行了电化学分析以量化L. sphaericus HJ-3的电子生成能力，并提出了GO还原的潜在机制。第四，研究了GO与L. sphaericus HJ-3之间的生物界面处的电子转移途径，通过代谢组学分析提出了一个还原途径，该途径强调了核黄素和氨基酸代谢的重新编程。最后，评估了外源性ETMs对微生物电子穿梭过程的影响，以提高还原效率。本研究显著推进了对革兰氏阳性细菌细胞外电子转移机制及其在GO还原中作用的理解，同时也为生物技术和环境修复应用提供了见解。
试剂和化学品
本研究中使用的GO由Tanfeng Graphene Technologies Co. Ltd（中国苏州）提供。核黄素（RF）、胭脂红（CAR）、蒽醌-2-磺酸（AQS）、2-羟基-1,4-萘醌（HNQ）和蒽醌-2-羧酸（AQC）购自Aladdin Biochemicals & Technologies, Inc。氯化钠（NaCl）和其他化学品由Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd（中国上海）提供。胰蛋白胨和酵母提取物购自OXOID（英国）。
形态特征及菌株的生理和生化特性
活化的HJ-3菌株通过平板划线法在Luria-Bertani固体培养基上纯培养，HJ-3菌株在固体培养基上的生长情况如图1A所示。培养24小时后，培养基上形成了表面湿润、中心隆起且边缘整齐的圆形奶油黄色菌落，菌株生长状况良好。图1B显示了HJ-3菌株的扫描电子显微镜图像，可以清楚地看到细菌呈长杆状
结论
本研究表明L. sphaericus HJ-3通过直接细胞色素介导的电子转移和黄素依赖的穿梭作用有效还原GO。全基因组测序确认了完整的呼吸链和黄素生物合成途径，代谢组学分析显示核黄素和氨基酸代谢增强，qRT-PCR显示关键电子转移基因上调。结合严格的对照实验，这些结果证实了
CRediT作者贡献声明
Jinyang Chen：撰写——原始草稿、方法学、实验设计、数据整理。Xiaoyu Lin：验证、实验设计、数据分析。Wei Wang：方法学、数据分析。Li Gan：撰写——审稿与编辑、监督、资金申请。Zuliang Chen：撰写——审稿与编辑、监督、资金申请、概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（51978168）和福建师范大学人才建设基金（Z0210509）的财政支持。
