《Phytopathology Research》：Conserved Golgi nucleoside diphosphatases drive protein glycosylation and virulence in Fusarium graminearum
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本研究聚焦植物病原真菌禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum），系统阐释了其高尔基体定位的鸟苷二磷酸酶（GDPases）FgGda1与FgYnd1在真菌发育与致病性中的关键作用。文章揭示了FgGda1是驱动蛋白糖基化依赖性真菌发育与致病性的主要因素，而FgYnd1仅提供部分功能冗余。通过遗传学与糖蛋白组学分析，研究发现FgGDA1缺失导致糖蛋白谱全局性重塑，尤其在碳代谢相关酶类中变化显著，明确了该酶在植物病原真菌致病机理中的核心地位。
高尔基体核苷二磷酸酶FgGda1与FgYnd1的鉴定与定位
研究首先在禾谷镰刀菌中鉴定出两个潜在的GDPase同源基因，分别命名为FgGDA1和FgYND1。系统发育分析显示，GDPase蛋白明确分为Gda1和Ynd1两个进化枝。这两个蛋白均含有一个保守的核苷磷酸酶结构域，表明它们是禾谷镰刀菌中保守的GDPase。为了确定其亚细胞定位，研究人员构建了FgGDA1-GFP和FgYND1-GFP融合蛋白，并与高尔基体标记蛋白FgSft2-RFP共表达。荧光显微观察显示，在分生孢子和菌丝等发育阶段，FgGda1和FgYnd1均与FgSft2-RFP清晰共定位，证实了它们是定位于高尔基体的GDPase。
FgGDA1对真菌生长发育与致病性至关重要
通过基因敲除、回补和过表达等遗传操作，研究人员系统评价了FgGDA1和FgYND1的功能。表型分析表明，缺失FgGDA1导致严重的营养生长缺陷，在完全培养基（CM）和基本培养基（MM）上生长均显著受阻；而缺失FgYND1仅引起轻微的发育问题。在生殖发育方面，ΔFggda1突变体完全丧失了产生子囊壳的能力，且无性产孢（分生孢子产生）能力急剧下降，产生的分生孢子形态异常、长度显著缩短。然而，这些突变体在脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）毒素产量上与野生型无显著差异。
致病性测定进一步凸显了FgGDA1的关键作用。在小麦穗部进行单花接种后，ΔFggda1突变体虽然能定殖于接种的小花，但无法向相邻小花扩展；而野生型及其他遗传改造菌株则在接种21天后引发典型的赤霉病症状。通过表达胞质GFP的菌株观察菌丝在小麦穗轴中的扩展情况发现，在接种6天后，携带野生型FgGDA1等位基因的菌丝能通过穗轴节间扩散至邻近小花，而ΔFggda1突变体的菌丝则完全被限制在接种小花内。这些结果综合表明，FgGDA1是禾谷镰刀菌正常发育和完全致病力所必需的，而FgYND1的作用相对次要。
FgYND1对FgGDA1缺失的功能补偿具有局限性
为了探究两个GDPase之间的遗传关系，研究人员检测了在单基因敲除背景下另一基因的表达水平。有趣的是，当其中一个GDPase编码基因被敲除时，另一个基因的表达会上调，暗示二者之间存在相互调节。进一步的遗传上位性分析通过构建双突变体和过表达组合菌株（如ΔFggda1·FgYND1oe）来验证功能冗余性。结果表明，过表达FgYND1能部分缓解ΔFggda1的营养生长缺陷，但同时敲除两个基因则导致菌株近乎致死，这与在人类病原真菌新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）中的发现一致。
在发育表型挽救方面，ΔFggda1·FgYND1oe菌株部分恢复了子囊壳的产生能力，但子囊壳常发育不成熟或为空壳。分生孢子形态基本恢复正常，产孢量也有适度恢复。在致病性方面，过表达FgYND1部分挽救了ΔFggda1突变体在小麦胚芽鞘上的侵染缺陷，并增强了其在小麦穗部的病害发展，但仍未能达到野生型的完全致病水平。这些遗传和形态学数据共同表明，尽管FgGDA1和FgYND1在同一高尔基体通路中发挥作用，但FgYND1仅能提供有限的功能补偿，FgGDA1对于真菌的完全发育和致病力是不可或缺的。
糖蛋白组学揭示FgGDA1与蛋白糖基化的紧密关联
基于GDPase在糖核苷酸转运和蛋白糖基化中的已知功能，研究假设FgGDA1通过调控禾谷镰刀菌的蛋白糖基化来影响其致病性。为验证此假设，研究人员对野生型和ΔFggda1突变体进行了基于伴刀豆球蛋白A（ConA）的糖蛋白组学分析。共鉴定出125种糖蛋白，其中在突变体中有55种上调，21种下调。
主成分分析（PCA）显示，野生型和ΔFggda1突变体的糖蛋白组谱存在清晰分离，表明FgGDA1缺失对全局糖蛋白构成产生了强烈影响。对上调糖蛋白的基因本体（GO）富集分析突出了“碳水化合物衍生物代谢过程”等通路。功能富集网络分析进一步显示，碳代谢是受影响糖蛋白的核心节点，包括柠檬酸合酶、丙酮酸脱氢酶亚基和丙酮酸脱羧酶等关键酶。这些数据表明，FgGDA1强烈影响蛋白的糖基化谱，尤其是与碳代谢相关的蛋白。
研究人员还检测了已知的N-和O-甘露糖基化相关基因（如OST1、OST5、PMT1、PMT2）的表达。与野生型相比，ΔFggda1突变体中O-甘露糖基转移酶基因FgPMT1和FgPMT2的转录水平提高了约两倍。然而，对真菌细胞壁O-连接聚糖的分析显示，野生型、ΔFggda1和ΔFgynd1突变体之间的谱图没有显著差异。这些结果共同说明，FgGDA1广泛影响蛋白糖基化，但对禾谷镰刀菌细胞壁蛋白的O-连接聚糖结构影响较小，这与它在人类病原真菌白念珠菌（Candida albicans）中的作用模式不同。
讨论与结论：FgGda1是蛋白糖基化与致病性的核心调控因子
本研究对禾谷镰刀菌中GDA1和YND1同源基因进行了功能表征，揭示了缺失FgGDA1会导致多效性的严重表型缺陷。FgGDA1对真菌的整体发育和致病性贡献巨大，而过表达FgYND1仅能部分挽救由FgGDA1缺失引起的发育缺陷。尽管FgGDA1未显著改变细胞壁聚糖结构，但研究明确证明了野生型和ΔFggda1突变体之间存在截然不同的糖蛋白组谱。
研究结果将FgGDA1确立为禾谷镰刀菌蛋白糖基化的关键调控因子。其作用机制可能与维持高尔基体内GDP-甘露糖前体的供应有关，从而保障正常的蛋白甘露糖基化。FgGDA1的缺失可能触发了糖基化相关基因表达上调的负反馈响应，并导致碳代谢等关键通路中酶蛋白的糖基化状态发生改变，这种异常的糖基化修饰可能破坏正常的细胞过程，最终导致生长缺陷和致病力丧失。这项工作为理解植物病原真菌中高尔基体驻留酶如何通过调控蛋白糖基化来影响发育和致病性提供了重要见解。
