简化的人类中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的流式细胞术定量分析方法

《Journal of Inflammation》：Simplified flow cytometric quantification of human neutrophil extracellular traps (NETs)

中性粒细胞胞外陷阱（NETs）形成导致的NETosis是一种独特的细胞死亡形式，现有检测方法存在灵敏度低、易混淆等问题。本研究开发了一种基于流式细胞术的简捷检测体系：通过固定人源中性粒细胞，采用抗DNA/Histone 1和抗H2A双抗体染色，双荧光阳性细胞被定义为NETotic。该方法通过图像流式细胞术验证准确性，并成功区分NETosis与凋亡、坏死及其他中性粒细胞激活状态，显著降低假阳性率。其灵活性和简便性为探索NETosis新标志物及疾病机制提供了可靠工具。

　　

摘要

多种细胞途径会导致中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的形成，这是一种不同于凋亡和坏死细胞死亡的细胞死亡形式。令人惊讶的是，目前仍缺乏能够有效量化NETosis及其相关途径的方法。在这里，我们描述了一种简单、灵敏、可靠且灵活的流式细胞术检测方法，该方法可以高效地检测和量化NETosis。在核心检测中，分离出的原代人类中性粒细胞首先与刺激物（如PMA/离子霉素）孵育，有时会加入抑制剂，随后进行固定。固定后的细胞被封闭处理，再与抗DNA/组蛋白1和抗组蛋白H2A抗体孵育，以同时检测组蛋白1和组蛋白H2A。具有H1-DNA/H2A双荧光的细胞被视为发生了NETosis。通过成像流式细胞术验证了NETosis检测/量化的准确性。利用已建立的NET诱导剂，并结合现有的方法学，确认了几条关键的NETosis途径。重要的是，我们这种基于流式细胞术的NETosis检测方法能够有效区分NETosis与中性粒细胞的活化过程，以及凋亡和坏死细胞死亡。我们认为，我们的方法将补充现有的NETosis检测方法，同时减少人为误差、主观性以及现有方法中不可避免的假阳性结果（这些假阳性可能来源于中性粒细胞活化和其他细胞死亡过程）。此外，我们方法的简单性和灵活性使得可以研究更多的NETosis相关标记物和途径，使其成为NETosis研究以及深入理解NETosis相关疾病发病机制的重要工具。