《Journal of Neuroinflammation》：From pathogenesis to therapy: the emerging role of regulatory T cells in amyotrophic lateral sclerosis
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该综述系统阐述了调节性T细胞（Tregs）在肌萎缩侧索硬化症（ALS）中的动态变化与核心作用机制，强调了其在神经免疫炎症中的关键调控功能，并系统梳理了以Tregs为靶点的临床试验（如Treg细胞移植、低剂量IL-2、Rapamycin等）及新兴细胞治疗策略（如CAR-Tregs、TCR-Tregs），为理解ALS病理机制和开发新型免疫干预疗法提供了全面视角与重要方向。
引言
肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis， ALS）是一种致命的神经退行性疾病，其特征是大脑和脊髓中运动神经元的进行性丧失，其发病机制至今仍未完全阐明。近年来越来越多的证据表明，神经免疫炎症在ALS中扮演着关键角色，其中调节性T细胞（Regulatory T cells， Tregs）作为神经免疫反应的关键调节者脱颖而出。当前获批的药物如利鲁唑（Riluzole）、依达拉奉（Edaravone）和托夫生（Tofersen）主要旨在延缓疾病进展而非治愈，这一局限性可能源于我们对ALS致病机制理解的不完全。在众多假说中，神经免疫炎症始终是ALS发生和发展的关键驱动因素。T细胞作为细胞免疫的核心，其中CD4+T细胞具有高度异质性，而Tregs则提供抗炎、免疫抑制和神经保护功能，在调节ALS相关的神经免疫炎症中显示出重要性。
调节性T细胞（Tregs）的基本生物学概述
根据来源，Tregs基本可分为三类：胸腺来源的自然调节性T细胞（nTregs）、外周来源的调节性T细胞（pTregs）以及在受控实验条件下由常规T细胞诱导产生的诱导性调节性T细胞（iTregs）。谱系决定转录因子叉头盒蛋白P3（Forkhead box protein P3， FOXP3）的持续表达对维持Tregs的免疫抑制表型和功能至关重要。其稳定表达受到表观遗传调控，特别是位于FOXP3基因第一个内含子内的高度保守非编码区域——Treg特异性去甲基化区域（Treg-specific demethylated region， TSDR）的甲基化状态，被认为是Treg谱系稳定性和功能完整性的关键分子标志。此外，白细胞介素-2（Interleukin-2， IL-2）在Tregs的发育和维持中起着核心作用。Tregs组成性表达高水平的IL-2Rα（CD25），与IL-2结合后激活Janus激酶JAK1和JAK3，导致信号转导和转录激活因子5（STAT5）磷酸化，进而维持FOXP3转录和Tregs的表型稳定。
Tregs通过多种机制介导免疫抑制：1）抑制性细胞因子释放：分泌IL-4、IL-10、IL-35和TGF-β等抗炎细胞因子；2）诱导细胞溶解：产生并释放颗粒酶B和穿孔素，诱导效应T细胞、B细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）的裂解和凋亡；3）细胞-细胞接触抑制：通过细胞表面细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）与树突状细胞（DCs）表面的共刺激分子CD80/CD86结合，诱导DCs产生强效免疫调节酶吲哚胺2，3-双加氧酶（IDO），并抑制DCs成熟；4）靶细胞代谢阻断：高表达IL-2受体并大量消耗IL-2，竞争性剥夺效应T细胞（Teffs）所需的IL-2，同时其表面的CD39和CD73水解ATP和二磷酸腺苷为腺苷，对Teffs产生抑制和抗增殖作用。
Tregs在ALS发病机制中的作用
在ALS中，受损的运动神经元释放促炎信号，诱导小胶质细胞转化为促炎的M1表型，星形胶质细胞也转变为A1型反应性表型，释放神经毒性分子，加剧神经元损伤。Tregs通过多种机制在ALS中发挥抗炎和神经保护作用。在疾病早期，Tregs数量增加并分泌IL-4、IL-10和TGF-β等细胞因子，促进小胶质细胞向抗炎的M2样表型极化，并通过过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）和核因子κB（NF-κB）等信号通路抑制炎症因子表达。此外，Tregs还通过分泌神经调节蛋白双调蛋白（amphiregulin）与星形胶质细胞相互作用，调节其增殖和活性。
然而，随着ALS进展，Tregs的数量和功能逐渐下降，外周Th1与Th17细胞比例显著增加，促炎因子水平上升而抗炎因子水平下降。“SWITCH模型”假说指出，时间因素在ALS免疫反应的动态演变中起关键作用。该假说认为，Tregs在ALS早期发挥有效的神经保护作用；但随着疾病进展，Tregs逐渐被大量浸润中枢神经系统的促炎性CD4+T细胞所取代，导致免疫状态从以Tregs为主的保护性状态转变为以炎症细胞为主的神经毒性状态。动物实验也支持这种时间依赖性动态演变。在mSOD1G93A小鼠中，在缓慢进展期（100日龄），Tregs数量显著增加，伴随IL-4、IL-10和TGF-β表达升高，协同抑制Teff增殖和IFN-γ产生。而在快速进展期（160日龄），Teffs的增殖和细胞毒能力增强，而Tregs数量下降且抑制活性减弱。
临床研究同样证实了Tregs功能与疾病进程的相关性。研究表明，ALS患者的Tregs数量减少，且这种减少与疾病进展速度和严重程度增加相关。此外，ALS患者Tregs抑制Teff增殖的能力受损，在疾病快速进展的患者中尤为明显。表观遗传学分析发现，ALS患者的Tregs在TSDR区域具有更高的甲基化水平，这可能导致其功能失调。值得注意的是，体外实验表明，经过IL-2和雷帕霉素（Rapamycin）刺激扩增后，来自ALS患者的Tregs能够恢复其抑制相应Teffs的能力。其他研究也发现，ALS患者外周血中Tregs总数与疾病进展速度呈显著负相关，且活化的Tregs频率与改善的生存率相关。单细胞RNA测序整合蛋白质组学进一步揭示，在快速进展的ALS中，Treg稳定性降低，伴随Th17/Treg、Th1/Treg和记忆CD4/Treg比率显著增加，以及Treg向Th17的转化。
临床试验
基于Tregs在ALS中的关键免疫调节作用，多项旨在增强Treg数量和功能的临床试验已经开展。
Treg细胞移植
Treg细胞疗法基于体外分离、扩增并回输Tregs的原理。2018年，Thonhoff等人进行了首次开放标签、非对照的I期临床试验，结果显示Treg输注安全且耐受性良好，且Treg抑制功能的增强与ALS患者疾病进展减慢显著相关。2022年，一项随机、双盲、安慰剂对照的2a期临床试验进一步评估了Treg/IL-2联合治疗的安全性、生物活性及其对疾病进展的潜在影响，结果表明该方案总体耐受性良好，无严重不良事件，且治疗显著增强了Tregs的免疫抑制功能。最近，Shneider等人报告了一项研究，6名ALS患者接受了固定剂量的脐带血来源、非HLA匹配的同种异体Treg产品CK0803治疗，结果显示患者疾病进展显著减缓，且伴随血浆神经丝蛋白水平下降。此外，自体多克隆Tregs注射剂（NP001）已获得美国FDA的研究性新药申请（IND）许可，并被授予治疗ALS的孤儿药资格，这是全球首个通过鞘内注射给药的Treg细胞疗法，目前在中国郑州大学第一附属医院已完成首例临床给药，初步结果显示患者病情稳定。
IL-2
IL-2在Tregs的产生、存活、稳定性和功能维持中至关重要。由于Tregs和Teffs对IL-2受体亲和力的差异，低剂量IL-2（ld-IL-2）策略被广泛应用于选择性扩增Tregs。Camu等人进行的IMODALS IIa期试验表明，ld-IL-2能够选择性扩增功能性Treg细胞，改善ALS患者的免疫微环境并抑制炎症。大型长期随机对照研究MIROCALS试验结果显示，在调整基线预后协变量后，ld-IL-2治疗组的死亡风险显著降低，且治疗持续显著增加了外周血Tregs数量并降低了血浆CCL2水平。基于脑脊液磷酸化神经丝重链（CSF-pNFH）水平的分层分析显示，在低CSF-pNFH水平的患者亚组中，ld-IL-2治疗显著降低了死亡风险。另一项开放标签研究评估了IL-2与阿巴西普（CTLA4-Ig， Abatacept）联合治疗的安全性和对免疫及氧化应激标志物的影响，结果显示联合方案安全且耐受性良好，伴随Tregs数量和免疫抑制功能增加，以及氧化应激、神经炎症和神经元变性相关生物标志物水平下降。
雷帕霉素（Rapamycin）
雷帕霉素是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的高效抑制剂，主要通过抑制mTORC1的活性，促进FOXP3表达，诱导Tregs分化并增强其免疫抑制功能。研究已建立从ALS患者外周血中分离CD4+CD25+Tregs并利用含雷帕霉素和IL-2的培养体系进行体外扩增的GMP流程，能显著恢复其免疫抑制能力。然而，一项评估雷帕霉素对ALS患者Tregs水平影响的多中心随机双盲临床试验未达到主要终点，未能证明低剂量雷帕霉素治疗对Tregs水平的显著影响，但确认了其在ALS患者中的良好安全性和耐受性。
RNS60
RNS60是一种含有氧合电荷稳定纳米结构（CSN）的实验性治疗药物，在临床前ALS模型中显示出通过增加外周CD4+/FOXP3+Tregs数量来发挥神经保护作用的潜力。初步开放标签试验表明长期使用RNS60安全且耐受性良好，但未观察到血液中FOXP3 mRNA和IL-17水平的显著变化。随后的II期随机对照试验也未显示RNS60对炎症和神经变性相关生物标志物、ALSFRS-R评分或生存有显著影响。然而，后续分析提示在呼吸功能下降较慢或特定生物标志物水平较低的亚组患者中，RNS60可能延长生存期。
富马酸二甲酯（Dimethyl fumarate， DMF）
DMF已被批准用于治疗复发缓解型多发性硬化症。研究表明，DMF可通过激活Treg细胞中的Nrf2信号通路促进FOXP3表达，从而上调Tregs数量。然而，针对ALS患者的II期TEALS试验结果显示，DMF在主要终点ALSFRS-R评分上未显示出显著优势，在神经炎症、生存率和呼吸功能等次要终点上也与安慰剂无显著差异，但确认了其在散发性ALS患者中具有良好的安全性和耐受性。
维生素D（Vitamin D）
维生素D的活性形式1α，25-二羟基维生素D3（1，25(OH)2D3）可能通过上调FOXP3表达诱导CD4+T细胞分化为免疫抑制性Tregs。关于维生素D水平与ALS疾病进展或生存率之间潜在关联的研究结果不一致。一些研究发现严重维生素D缺乏个体的ALSFRS-R评分下降速度更快，中位生存期显著缩短；而另一些研究则发现较高的血清维生素D水平反而与ALS患者不良预后相关，或未发现维生素D浓度与ALS生存率存在显著相关性。一项针对维生素D不足的ALS患者的前瞻性随机对照研究显示，补充维生素D3并未显著改善患者的运动功能。一项名为VITALS的临床研究正在进一步探索维生素D在ALS中的免疫调节作用。
粪便微生物移植（Fecal microbial transplantation， FMT）
肠道菌群失衡与ALS的发生和发展密切相关。基于此，提出了通过干预肠道菌群来改善ALS患者免疫炎症状态的策略，FMT已成为一种潜在的干预手段。一项于2019年启动的多中心随机双盲临床试验旨在评估FMT对早期ALS患者的治疗潜力，主要观察指标是第6个月时干预组与对照组之间Tregs数量的变化，该研究结果尚未公布。
Treg细胞治疗策略的方向
针对Tregs以增加其数量或改善其与Teffs的比例，具有更高的特异性和安全性，是临床应用的有前景的选择。充足的、稳定的Tregs对于实现细胞治疗疗效至关重要，其主要来源包括脐带血（UCB）、成人外周血（APB）和新生儿胸腺。目前临床常用的Treg治疗策略包括多克隆Treg细胞、TCR-Tregs和嵌合抗原受体Tregs（CAR-Tregs）。多克隆Treg细胞是最常用的类型，但在缺乏抗原特异性的情况下，难以精确靶向特定病灶区域。为了增强治疗特异性，研究人员探索了使用抗原呈递细胞（APCs）在体外产生抗原特异性Tregs。近年来，工程化调节性T细胞（engineered Tregs）取得了进展，它结合了多克隆Tregs的可扩展性和抗原特异性Tregs的精准性，主要分为TCR-Tregs和CAR-Tregs两种方法。TCR-Tregs通过慢病毒或逆转录病毒转导将抗原特异性T细胞受体引入Tregs，使其能够识别特定的肽-MHC复合物。相比之下，CAR-Tregs被工程化表达嵌合抗原受体，可以直接识别靶组织表面表达的完整蛋白，具有更广泛的识别谱和更大的靶向灵活性。
此外，许多研究致力于通过新技术增强Treg细胞的表型稳定性。一种策略是利用CRISPR干扰/激活（CRISPRi/a）系统，通过靶向沉默X失活特异转录本（XIST）和激活内源性FOXP3基因表达，来恢复Treg细胞中FOXP3的稳定表达和功能。同时，在体外扩增过程中添加IL-2和TGF-β等细胞因子也有助于维持FOXP3表达并增强细胞稳定性。表观遗传水平的调控也受到关注，例如通过作用于TSDR的甲基转移酶可以稳定FOXP3启动子的活性状态。此外，还提出了针对FOXP3剪接变体的调控策略，研究人员使用剪接转换寡核苷酸（SSOs）诱导剪接为功能完整的全长形式，有望进一步增强Treg的功能稳定性。与外源性诱导或递送系统相关的功能增强策略也受到关注，例如脂质体递送系统可以共同递送抗原肽和活性维生素D3至引流淋巴结中的树突状细胞，诱导抗原特异性Treg分化。此外，从Treg细胞分离的外泌体也表现出与Treg相似的免疫抑制和耐受诱导能力，具有成为Treg替代疗法的潜力。
