TIPE2基因的敲除通过激活NF-κb信号通路，增强了NKG2D CAR-T细胞对胰腺癌的抗肿瘤效果

《Journal of Translational Medicine》：TIPE2 knockdown enhances the anti-tumor efficacy of NKG2D CAR-T cells against pancreatic cancer via activating NF-κb signaling pathway

TIPE2抑制增强NKG2D-CAR-T细胞抗肿瘤活性及机制研究，通过整合shRNA敲低TIPE2构建新型CAR-T细胞，发现其显著提升细胞激活、细胞毒性及增殖，降低耗竭和凋亡，NF-κB信号增强介导此效应，并验证了小鼠胰腺癌模型中的高效抗肿瘤作用。

　　

摘要

背景

肿瘤坏死因子-α诱导的蛋白8样2（TIPE2）是一种细胞内免疫检查点蛋白，已知可抑制T细胞的激活和效应功能。尽管它在限制T细胞反应中起作用，但CAR-T细胞仍容易受到TIPE2介导的抑制信号的影响。因此，我们假设抑制这一免疫检查点将增强CAR-T细胞的抗肿瘤功能。

方法

为了克服TIPE2介导的负调控，我们通过将针对TIPE2的shRNA序列直接整合到CAR构建体中，开发了一种新型的第二代NKG2D基CAR-T细胞。通过qPCR和Western blot分析检测了CAR构建体中TIPE2的敲低效率。通过流式细胞术在体外评估了TIPE2下调的CAR-T细胞的功能和机制特性，包括激活、细胞毒性、耗竭、凋亡、增殖和分化等方面的分析。进一步使用临床前胰腺癌小鼠模型在体内验证了其抗肿瘤效果。

结果

流式细胞术分析显示，TIPE2缺陷的CAR-T细胞表现出显著更高的激活（CD69）、脱颗粒（CD107a）、细胞毒性（GzmB）和细胞因子（IFN-γ）标志物表达，从而比传统CAR-T细胞更有效地清除肿瘤细胞。TIPE2沉默还减少了T细胞的耗竭，降低了凋亡敏感性，并在与Panc-28胰腺癌细胞共培养时增强了增殖。此外，TIPE2抑制使CAR-T细胞的分化偏向效应型（T$_{EFF}$），其特征是T-bet表达升高和Eomes生成减少。从机制上讲，这些功能增强是通过NF-κB信号通路的增强来实现的，这一点通过p-p65表达升高以及NF-κB抑制后的功能逆转得到了证实。一致地，与野生型CAR-T细胞相比，TIPE2缺陷的CAR-T细胞在体内的抗肿瘤效果显著提高。

结论

我们成功开发了TIPE2下调的NKG2D-CAR-T细胞，这些细胞表现出增强的激活和细胞毒性，同时限制了对表达NKG2D配体的胰腺肿瘤的凋亡和耗竭，这表明TIPE2是一个有前景的细胞内免疫检查点靶点，有助于优化实体瘤中的CAR-T细胞疗法。