《Journal of Translational Medicine》：A novel iPSC model of Bryant-Li-Bhoj neurodevelopmental/neurodegenerative syndrome demonstrates the role of histone H3.3 in chromatin dynamics, neuronal differentiation, and maturation
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本研究构建了一个新颖的携带H3-3B L48R（Leu48Arg）变异的诱导多能干细胞（iPSC）模型，并分化为二维神经祖细胞（NPC）、前脑神经元（FBN）和三维背侧前脑类器官（DFBO），以阐明该变异在Bryant-Li-Bhoj神经发育/神经退行性疾病（BLBS）中的致病机理。通过多组学方法，研究发现该变异导致H3-3B表达上调，进而引起组蛋白H3.3在核小体中过度沉积，改变了染色质可及性，并最终扰乱了影响神经细胞命运、细胞粘附、神经传递以及兴奋/抑制平衡的关键基因表达。
摘要
Bryant-Li-Bhoj综合征（BLBS）是一种由编码组蛋白H3.3的基因H3-3A和H3-3B变异引起的神经遗传疾病。患者几乎普遍表现出发育迟缓/智力障碍，但H3.3变异导致这些表型的机制尚不清楚。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，将BLBS相关的H3-3B p.Leu48Arg（L48R）变异引入人类iPSCs，并分化为2D神经祖细胞（NPCs）、2D前脑神经元（FBNs）和3D背侧前脑类器官（DFBOs），以研究其对神经发育的影响。
背景
神经发育障碍（NDD）通常由神经发育早期阶段基因损伤后表观遗传机制成分的异常引起。孟德尔表观遗传机器病（MDEMs）由编码组蛋白修饰相关蛋白的基因发生种系变异导致。组蛋白H3.3是一种复制非依赖性的组蛋白变体，在神经元中含量丰富，对于建立染色质景观和神经元身份至关重要。BLBS是由H3-3A或H3-3B杂合种系变异引起的NDD，患者表现为神经和颅面特征，其中最常见的是发育迟缓/智力障碍。目前尚缺乏有效的靶向疗法。因此，本研究旨在利用人类iPSC模型探究H3.3 L48R变异的致病机制。
方法
本研究使用了同基因对照和携带L48R变异的iPSCs。通过多能性标记物（OCT4、NANOG）验证细胞身份。使用双SMAD抑制方案将iPSCs分化为NPCs，并用流式细胞术分析祖细胞标志物。NPCs进一步分化为FBNs，并用免疫荧光（IF）分析神经和胶质标志物（如TUJ1、GFAP、MAP2、VGLUT1）。此外，建立了3D背侧前脑类器官模型，并在不同时间点（D25、D62、D90）进行分析，使用免疫荧光评估细胞组成（SOX2、Ki67、BrdU、CTIP2、PAX6、GABA、NeuN、MAP2）和全细胞膜片钳记录评估电生理特性。在2D模型（iPSCs、NPCs、FBNs）中，通过RNA测序（RNA-seq）分析基因表达变化，通过ATAC测序（ATAC-seq）分析染色质可及性变化，并进行基因本体（GO）富集和转录因子结合基序分析。同时使用蛋白质印迹和免疫荧光验证了H3.3的蛋白水平。使用RT-qPCR验证RNA-seq的关键发现。
结果
L48R变异影响iPSC向2D神经谱系的分化
携带L48R变异的iPSCs保持了多能性，其OCT4和NANOG表达与对照无显著差异。然而，在分化为NPCs时，L48R细胞的祖细胞标志物NES和SOX1表达降低。分化得到的FBNs在成熟标记物（如MAP2阳性神经元延伸和VGLUT1表达）上减少，而星形胶质细胞标志物GFAP的mRNA水平显著增加。这表明L48R变异损害了iPSC向神经元谱系的早期分化及随后的成熟。
L48R变异引起广泛的转录组和染色质可及性改变
RNA-seq分析显示，在NPCs中，L48R变异导致139个基因表达差异，涉及细胞迁移、突触组织、轴突生成调节等过程。特别是，与细胞粘附和轴突发育相关的基因（如CDH4、WNT7A、PLXNA3）表达异常。在FBNs中，差异表达基因数量巨大（1738个），并富集在与突触活性、神经递质摄取、细胞周期相关的通路上。立即早期基因EGR1、FOSL1、JUNB和NPAS4表达下调。
ATAC-seq分析显示，与对照相比，L48R NPCs的染色质整体更开放，尤其是在转录起始位点附近。共鉴定出350个差异可及的染色质区域。这些区域关联的基因功能富集于神经元发育和轴突生成。例如，与轴突延伸相关的PLXNA3位点染色质可及性增加，而与神经元剪接相关的RBFOX1位点染色质变得更为致密。转录因子结合分析预测，PBX1和ARX等与神经发生相关的转录因子在L48R细胞中结合增加，而TP63（涉及神经元分化）和EMX2（前脑发育）的结合减少。这些转录因子结合的变化可能与下游基因（如DPP6、GABRG3、GABRA5、CDH4、WNT7A、PLXNA3）的表达失调有关。
L48R变异导致H3-3B表达上调和H3.3过度沉积
RNA-seq和RT-qPCR证实，在L48R NPCs和FBNs中，H3-3B的mRNA表达显著上调，而H3-3A的表达无显著变化。蛋白质水平分析显示，FBNs中H3.3蛋白在细胞核内的沉积量增加，这表明L48R变异可能导致H3.3在染色质中异常积累。
L48R变异改变3D类器官的细胞组成和神经发生
在3D背侧前脑类器官模型中，早期（D25）L48R类器官体积更大，BrdU掺入增加，表明增殖性祖细胞池扩张。然而，到了后期（D62），L48R类器官中的增殖标志物Ki67和BrdU掺入显著减少，放射状胶质细胞标记物SOX2和PAX6的表达也降低。这表明L48R变异导致放射状胶质细胞从对称分裂（自我更新）过早转向不对称分裂，产生更多中间祖细胞（CTIP2阳性细胞增加），但最终导致维持增殖的祖细胞池耗竭。此外，成熟神经元标记物MAP2在L48R类器官中表达减少。同时，L48R类器官表现出GABA能信号增强，其GABA免疫染色强度和GABRG3的mRNA表达均高于对照。
L48R类器官中的神经元电活动降低
对成熟（D90）类器官进行全细胞膜片钳记录。与对照类器官相比，来自L48R类器官的神经元表现出自发兴奋性突触后电流（sEPSCs）频率和幅度显著降低，表明其突触传递功能受损。在电流刺激下，L48R神经元的动作电位发放能力也减弱。这些结果直接证明了L48R变异损害了神经元的电生理活性。
结论
本研究首次利用人类iPSC衍生的神经发育模型，揭示了BLBS致病性变异H3.3 L48R的分子机制。该变异导致H3-3B表达上调，引起H3.3在染色质中过度沉积，进而改变了染色质可及性和关键转录因子的结合，最终导致与细胞粘附、神经传递和兴奋/抑制平衡相关的基因表达失调。在功能上，这损害了放射状胶质细胞的自我更新和分化动力学，扰乱了神经元成熟，并降低了神经元的电活动。这些发现为理解BLBS的病理生理学提供了重要见解，并为未来针对此病及相关疾病的靶向治疗临床前开发和测试奠定了基础。
