在大肠杆菌中高效表达截短的Taq DNA聚合酶，并将其应用于针对线粒体细胞色素b的PCR检测，以实现清真食品的认证

《World Journal of Microbiology and Biotechnology》：Efficient expression of truncated Taq DNA polymerase in Escherichia coli and its application in mitochondrial cytochrome b–targeted PCR for halal authentication

国产重组TaqDNA聚合酶通过优化表达条件（诱导时间18h、IPTG浓度0.4mM、细胞密度OD600 0.6）实现145%产量提升，达10mg/L，并开发基于线粒体cyt b基因的PCR检测法，验证其在新鲜及加工肉类中有效检测猪肉DNA，与进口酶性能相当，为印尼Halal认证提供自主检测方案。

　　

摘要

使用聚合酶链反应（PCR）技术进行清真认证依赖于扩增来自非清真来源的特定DNA序列，这需要像Taq DNA聚合酶这样的耐热酶。目前，在穆斯林占多数的印度尼西亚，大多数商业清真检测试剂盒都依赖进口的Taq DNA聚合酶，从而导致获取受到限制。在这项研究中，优化了在含有pD871质粒的Escherichia coli BL21 Star (DE3)中表达的重组Taq DNA聚合酶（TaqPol）的生产过程，并在优化条件下将其作为清真检测试剂盒中的酶使用。系统地优化了表达参数，包括诱导后孵育时间、IPTG浓度和细胞密度（OD₆₀₀）。通过实验确定了最佳条件：诱导后孵育时间为18小时、IPTG浓度为0.4 mM以及OD₆₀₀为0.6。在这些优化条件下，酶的产量增加了约145%，每升培养液可产生10毫克纯化蛋白质，总活性达到2350 U。SDS-PAGE分析显示在大约63 kDa处有一个单一条带。为了提高清真检测的灵敏度和特异性，所使用的反向引物基于猪线粒体细胞色素b（cyt b）基因。这种方法能够检测新鲜和加工肉类产品中的猪DNA。此外，还通过优化退火温度和酶单位浓度来改善PCR性能。将这些优化措施应用于各种非清真测试样本，结果表明，65°C的退火温度和每25 μL反应0.5 U的酶浓度能够在各种样本类型中实现一致且特异的DNA扩增。这些结果证实了所优化参数适用于使用TaqPol的PCR技术进行清真检测。与进口Taq DNA聚合酶的比较分析显示，扩增效果的条带强度和清晰度相当。总体而言，这项研究表明TaqPol在印度尼西亚作为独立清真检测试剂盒具有巨大潜力，从而支持了印度尼西亚清真检测试剂盒的自主性。