《Nature Communications》：cGAS-IFN-I responses by extracting nuclear DNA from dying cells via nucleocytosis
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本文针对内源性自身DNA如何激活胞质cGAS-STING通路这一免疫学难题展开研究。研究人员发现了一种由巨噬细胞介导、称为“核胞作用”的新机制，即巨噬细胞能够直接访问并提取死亡细胞核中的DNA，从而激活cGAS/STING/IFN-I轴。研究阐明了溶酶体功能障碍和PPT1抑制引发细胞死亡及核钙网蛋白积累的分子机理，并通过活细胞成像技术直接观测到这一过程。该发现不仅揭示了抗病毒药物CADs发挥作用的间接机制，也为治疗自身DNA相关炎症性疾病提供了新的潜在药物靶点。
我们的免疫系统拥有一套精密的警报机制，用来识别和抵抗外来病原体的入侵。其中，cGAS蛋白就像一位驻扎在细胞质里的“DNA哨兵”，专门负责检测胞质内是否存在异常的双链DNA。当它发现病毒DNA等“外敌”时，会启动cGAS-STING信号通路，最终促使细胞产生大量的Ⅰ型干扰素，发起强有力的先天免疫反击。然而，这套精密的防御系统有时也会“误伤友军”——我们自身的DNA在某些情况下也能激活cGAS，引发不必要的炎症反应，这被认为与多种自身免疫性疾病、炎症乃至癌症的发生发展有关。但长期以来，一个核心谜团一直困扰着科学家：我们自身的DNA通常被安全地锁在细胞核内，它们究竟是如何“越狱”并进入细胞质，从而被cGAS“哨兵”发现的呢？传统的观点认为，这可能源于细胞内部压力导致的线粒体DNA泄漏或细胞器损伤。但对于大量细胞死亡后释放的自身DNA，巨噬细胞等免疫细胞是如何处理它们，并最终激活cGAS通路的，其具体机制并不清晰。
与此同时，一些经典的抗疟疾和抗病毒药物，如羟氯喹，在临床上表现出复杂的双重效应：它们既能用于抑制某些自身免疫病中的异常免疫反应，又能在一些病毒感染模型中展现出治疗效果。这些药物属于阳离子两亲性药物，已知能够影响溶酶体的功能，但其确切的、尤其是间接的抗病毒免疫调节机制仍属未知。这就像我们有一把已知能开关某扇大门的钥匙，却不完全清楚它最终是如何影响整个房间安保系统的。
为了回答上述问题，研究人员在《自然·通讯》杂志上发表了一项研究，他们综合利用了转录组测序、活细胞分泌活性成像、单细胞转录组测序、成像流式细胞术、全息断层扫描成像、计算机辅助药物设计等多种前沿技术，并结合了基因敲除小鼠模型进行体内外验证。研究团队使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子培养的骨髓来源细胞以及B16黑色素瘤细胞系等作为主要研究对象。
研究结果
cGAS/STING介导的抗病毒CADs产生强效IFN-I
研究人员首先发现，羟氯喹能够诱导骨髓来源细胞产生与强效激动剂cGAMP水平相当的IFN-β。进一步筛选证实，羟氯喹、氯喹、阿莫地喹、替洛隆、奎纳克林和AQ-13等多种阳离子两亲性药物均是强效的IFN-β诱导剂。机制研究表明，羟氯喹诱导的IFN-β产生完全依赖于TBK1、STING和cGAS，而不依赖于TLR信号通路。计算机模拟分析揭示了所有这些IFN-β诱导剂共有的三维药效团特征，提示它们可能作用于一个共同的靶点。
HCQ诱导细胞死亡及活细胞的强效IFN-β产生
通过活细胞分泌活性成像技术，研究人员实时观测到，与cGAMP相比，羟氯喹诱导的IFN-β分泌启动更慢、分泌细胞更少，但每个分泌细胞产生的IFN-β信号更强，呈现“穿孔状”，表明细胞粘附牢固。单细胞转录组测序分析证实，羟氯喹仅诱导巨噬细胞亚群表达IFN-β，且分泌细胞数量少但表达水平高。同时，时间推移成像显示羟氯喹处理会诱导细胞死亡，且所有IFN-β诱导剂均能引起细胞死亡，提示细胞死亡事件参与了IFN-β的产生。
直接访问死亡细胞核并提取DNA
成像流式细胞术发现，羟氯喹处理增加了含有活细胞和死细胞的多重体群。将野生型细胞与cGas或Sting1基因敲除细胞混合培养的实验证明，IFN-β的产生需要dsDNA在细胞间转移，而非cGAMP等可扩散信号分子。高分辨率显微镜和全息断层扫描成像清晰地捕捉到活细胞伸出突起状结构，直接接触并侵入死亡细胞的细胞核，同时伴随死亡细胞核内DNA信号的减少和活细胞内DNA信号的增加。肌动蛋白聚合抑制剂能特异性抑制羟氯喹诱导的IFN-β产生，证实了细胞骨架参与该过程。
IFN-β分泌前的核胞作用
活细胞分泌活性成像结合DNA染色显示，在IFN-β分泌之前，分泌细胞会附着在死亡细胞核附近，并将dsDNA摄取到其细胞质中。研究人员将这一由巨噬细胞执行的、直接访问并提取死亡细胞核DNA的新型细胞功能命名为“核胞作用”。
钙网蛋白的核转位
免疫荧光染色和细胞核蛋白质印迹分析表明，羟氯喹处理会导致内质网分子伴侣钙网蛋白从胞质转位到细胞核内。成像流式细胞术进一步量化了死细胞中钙网蛋白信号的增强及其与细胞核的相关性。已知胞外钙网蛋白可通过Rho/ROCK信号通路触发树突状细胞的树突延伸。研究发现，ROCK抑制剂能够抑制羟氯喹诱导的IFN-β产生，但不影响钙网蛋白的核转位或cGAMP诱导的反应，提示Rho激酶在核胞作用的细胞骨架重组步骤中发挥作用。
从溶酶体功能障碍到IFN-β产生
研究表明，单纯的溶酶体酸化抑制剂巴佛洛霉素A不足以诱导强效的IFN-β产生，尽管它能引起钙网蛋白的亚细胞定位改变。羟氯喹是棕榈酰蛋白硫酯酶PPT1的直接抑制剂。实验发现，PPT1抑制剂DC661能够诱导较弱的IFN-β产生，而补充PPT1的酯酶活性则可抑制羟氯喹诱导的反应。计算机模拟显示，所有IFN-β诱导剂都能结合PPT1的中央口袋，其结合亲和力与诱导IFN-β的潜力呈正相关。更有趣的是，同时使用DC661和巴佛洛霉素A可以协同诱导出强烈的、cGAS依赖性的IFN-β反应，并观察到核胞作用现象。这说明PPT1抑制引发的细胞死亡和溶酶体质子抑制（导致pH升高）共同触发了核胞作用及后续的强效IFN-I反应。
肿瘤细胞中的核胞作用
研究证实，经羟氯喹处理的B16黑色素瘤细胞和LLC肺癌细胞在死亡时，其细胞核内同样出现钙网蛋白积聚。当将这些处理后的死亡肿瘤细胞与骨髓来源的巨噬细胞共培养时，能够诱导后者产生IFN-β，表明肿瘤细胞也能发生诱导核胞作用的细胞死亡。
HCQ在体内诱导局部IFN-I反应
通过给小鼠口服羟氯喹并对其肺组织进行单细胞转录组测序分析，研究人员发现羟氯喹能在肺部诱发显著的STING依赖性IFN-I反应。干扰素刺激基因特征在单核来源巨噬细胞、上皮细胞和中性粒细胞等多种细胞类型中被诱导，表明由巨噬细胞启动的核胞作用能在局部组织引发广泛的抗病毒状态。
结论与讨论
该研究首次发现并命名了“核胞作用”——一种由巨噬细胞执行的、通过直接提取死亡细胞核DNA来激活cGAS-STING-I型干扰素轴的新型免疫机制。研究详细阐明了其分子路径：以羟氯喹为代表的、靶向PPT1的阳离子两亲性药物，通过同时抑制溶酶体酸化和PPT酶活性，诱导细胞发生一种特殊的死亡；在此过程中，钙网蛋白异常积累于细胞核内，作为“吃我”信号，引导邻近的巨噬细胞伸出突触直接侵入死亡细胞的细胞核，提取其中的DNA；这些DNA被递送至巨噬细胞胞质，激活cGAS-STING通路，最终导致强效的I型干扰素产生。
这项工作的意义重大。理论上，它破解了自身DNA如何直接激活胞质cGAS这一长期悬而未决的难题，为理解自身免疫性疾病、慢性炎症和癌症中异常免疫激活的起源提供了全新的视角和机制框架。技术上，研究整合了多种前沿的成像和组学技术，特别是活细胞分泌活性成像技术的应用，使实时观测免疫分子的分泌及其与细胞行为的关联成为可能，是方法论上的创新。应用上，研究不仅揭示了部分抗病毒药物（如羟氯喹）发挥作用的潜在间接免疫机制（即通过诱导核胞作用产生局部干扰素），更重要的是，它指出“诱导核胞作用的细胞死亡”本身可能成为一个可成药的靶点。这意味着，未来科学家或许能够开发出特异性诱发或抑制核胞作用的新型药物，从而用于治疗依赖该通路的感染性疾病、自身免疫病或增强癌症的免疫治疗效果。该研究将细胞死亡、先天免疫感应和抗病毒药物机制巧妙地联系起来，为免疫学和转化医学研究开辟了一个新的方向。
