《Legume Science》：Exopolysaccharide-Based Microencapsulation of Plant Growth-Promoting Bacillus Strains Improves Germination, Growth, and Yield of Chilean Common Bean Cultivars
编辑推荐：
本研究开发了一种由藻酸盐、壳聚糖和细菌胞外多糖（EPS）组成的复合水凝胶微囊化系统，用于包裹两株植物根际促生菌（PGPB）——Bacillus proteolyticusCyn1和Bacillus safensisCyn2。该系统显著提高了菌株在30天储存期的存活率（约70%），并成功应用于三种智利普通豆（Phaseolus vulgarisL.）栽培品种（“Zorzal”、“Sapito”和“Mantequilla”）的室内发芽、控制生长及大田条件测试。结果表明，该生物刺激剂处理能有效改善豆种的发芽率、早期生长指标（如株高、根数、生物量、叶绿素a含量），并最终在大田条件下提升豆荚数、种子数和最终产量，证明了EPS基复合微囊化系统在提高菌剂稳定性与田间表现、促进豆类作物可持续生产方面的应用潜力。
引言：可持续农业的微生物解决方案
豆类作物，如普通豆（Phaseolus vulgarisL.），因其能与微生物形成共生关系，对可持续粮食系统至关重要。这些共生关系有助于提高植物生产力、土壤肥力和生态恢复力。然而，传统农业系统过度依赖化学肥料，导致了环境污染、土壤退化等一系列问题。微生物生物刺激剂作为一种可持续的替代方案应运而生，它们可以改善土壤质量、优化养分利用、增强植物对非生物胁迫的耐受性。然而，这些有益微生物在实际应用中常常面临货架期短、在环境条件下存活率低的问题。微囊化技术通过聚合物基质保护微生物免受不利环境条件的影响，成为提高其存活率和功能性的有效策略。其中，细菌胞外多糖（EPS）作为一种天然、可生物降解的生物材料，在农业等多个领域显示出应用潜力。本研究旨在开发一种基于EPS的微囊化细菌生物刺激剂，以提高智利普通豆栽培品种的发芽和生长。
材料与方法：从菌株到田间试验的系统设计
本研究使用了三个智利普通豆栽培品种：“Zorzal”、“Sapito”和“Mantequilla”。所用的植物根际促生菌（PGPB）为先前从智利豆类植物根际土壤中分离的Bacillus proteolyticusCyn1和Bacillus safensisCyn2，它们具有产氨、产生长素、产铁载体、溶磷、ACC脱氨酶和过氧化氢酶活性等多种促生特性。用于生产EPS的菌株是Bacillus licheniformisTol1。
生物刺激剂的制备核心是微囊化过程。研究人员首先评估了两种PGPB菌株的生长曲线动态和形态特征，利用光密度监测和扫描电子显微镜（SEM）进行了表征。关键的微囊化步骤包括：将细菌悬浮液与3%（w/v）的海藻酸钠溶液混合，然后滴加到氯化钙（CaCl2）溶液中形成凝胶珠。随后，将海藻酸钙珠浸入壳聚糖溶液中形成涂层，最后加入1%（w/v）的细菌EPS溶液，形成由藻酸盐、壳聚糖和EPS组成的三元复合水凝胶微囊。
研究评估了微囊在4°C和22°C–24°C下储存30天的细菌存活率，采用活/死染色结合共聚焦显微镜进行观察。生物刺激剂的应用效果通过三个层级的试验进行评估：体外种子发芽试验、控制生长条件下的植物生长评估以及大田条件下的产量效应评估。统计分析采用了主成分分析（PCA）、Spearman相关性分析以及广义线性混合模型（GLMM）等方法。
结果：复合微囊系统的卓越性能与多维度促生效果
生物刺激剂的构建与特性
两种PGPB菌株均呈现典型的S型生长曲线，约5小时进入指数生长期。SEM图像确认了它们均为杆状形态。辅料相容性试验表明，海藻酸盐与两种菌株的相容性最高，而壳聚糖对细菌增殖有一定抑制作用。离子凝胶法成功制备了平均尺寸为3.6 ± 2.0 mm的球形微囊，加入壳聚糖和EPS涂层后，微囊颜色变为深棕色，表明聚合物间发生了成功的相互作用。SEM图像显示，仅含海藻酸盐的微囊表面光滑均匀，含有可见的嵌入细菌；加入壳聚糖后表面变得粗糙多孔；而三元复合体系（海藻酸盐-壳聚糖-EPS）则形成了更致密、分层的基质结构。
最关键的发现在于细胞存活率。共聚焦激光扫描显微镜结合活/死染色清晰表明，不同配方微囊的细菌存活率存在差异。在仅含海藻酸盐的微囊中，细菌存活率随时间下降明显，第30天时低于50%。含有壳聚糖涂层的微囊提高了初始细胞存活率，但在第30天也出现显著下降。相比之下，三元复合微囊系统（海藻酸盐-壳聚糖-EPS）在整个30天储存期内维持了最高且最持久的存活率，定量分析证实第30天时细菌存活率仍保持在70%左右。这表明EPS有助于形成一个更稳定的微环境，保护被封装的细胞免受干燥和结构降解的影响。
微囊化生物刺激剂的应用效果
体外种子发芽试验表明，生物刺激剂处理总体上改善了几个形态和发芽性状，其中“Mantequilla”品种的反应最为明显。例如，其总苗高从对照的16.40 ± 7.86 cm增加到处理组的24.10 ± 7.96 cm。根系发育也得到增强，“Mantequilla”和“Sapito”的根数显著增加。发芽率方面，“Sapito”和“Mantequilla”达到90%，而各自对照为70%–80%。多元统计分析（PCA）显示处理组和对照组存在部分分离，表明生物刺激剂应用影响了整体生长模式。然而，广义线性混合模型（GLMM）分析揭示，生物刺激剂对某些性状（如株高、胚芽长度）的效应并不显著，而品种解释了更大的变异比例。对于总根长和根数，处理效应是显著的，同时豆类品种也有强烈影响。
控制生长条件下的早期生长评估显示，生物刺激剂对三个豆类栽培品种的早期生长和生理参数产生了不同反应。“Zorzal”的株高从对照的28.2 ± 15.50 cm显著增加到处理组的45.35 ± 7.56 cm。“Sapito”的新鲜生物量显著增加。所有品种在生物刺激剂处理下新鲜生物量均增加，其中“Sapito”最为显著。叶数在“Zorzal”和“Mantequilla”处理组中增加。关于光合色素，生物刺激剂诱导了“Sapito”和“Zorzal”的叶绿素a含量增加。Spearman相关性矩阵揭示了新鲜生物量与干生物量、株高与根长以及叶绿素与生物量之间存在显著正相关。PCA解释了总变异的55.39%，显示生物刺激剂处理与对照部分分离。GLMMs分析表明，生物刺激剂处理显著增加了株高、新鲜生物量和叶数，且存在显著的品种与处理交互作用。
大田条件下的产量效应表明，生物刺激剂的应用持续改善了三个普通豆栽培品种的产量相关参数。最强的反应出现在“Sapito”品种，其每株豆荚数从88.9个增加到116.9个，每株豆粒数从343.4粒增加到418.0粒，单株产量从148.6 kg增加到192.7 kg。“Mantequilla”和“Zorzal”的豆粒数和产量也有增加。新鲜和干生物量在生物刺激剂应用下也均有所增加，特别是在“Sapito”品种中。PCA分析显示，对照处理的样本形成了生物刺激剂处理相关变异性中的一个子集，表明后者在生产力变量中包含了更广泛的反应范围。Spearman相关性矩阵显示，豆荚数与豆粒数之间存在非常强且显著的相关性。GLMMs分析表明，生物刺激剂对所有评估的普通豆生产性状（包括每株豆粒数、新鲜生物量、干生物量和总产量）均产生了积极且显著的影响。
讨论与结论：迈向可持续豆类生产的有效策略
复合微囊系统增强细菌存活率与持续释放
由藻酸盐、壳聚糖和EPS组成的复合水凝胶基质被证明在储存期间能有效保持细菌存活率。活/死共聚焦显微镜显示，三元复合基质配方即使在环境储存30天后仍保留了约70%的活细胞。这种增强可能源于复合水凝胶的协同物理化学特性，它提供了结构强化和渗透平衡，保护细菌免受干燥和氧化应激。SEM成像确认了两种PGPB菌株在基质中的掺入和均匀分布。三层水凝胶基质显示出致密且有组织的表面特征，支持了细菌逐渐、持续释放的假说。这种结构完整性对于确保PGPB在根际随时间保持活性、促进植物早期发育的长期刺激至关重要。重要的是，微囊化保护了PGPB菌株免受生物和非生物胁迫，如污染物、土壤拮抗物、温度波动、干燥、紫外线和机械应力，通过提供一个有益的微环境来延长其货架期并维持代谢活性。
生物刺激剂应用改善普通豆的发芽、幼苗表现和田间表现
生物刺激剂的有效性与作物应用时的物候阶段密切相关。在本研究中，尽管某些品种的发芽率略有改善，但这些差异在统计上并不显著。相比之下，在早期生长阶段观察到了更一致和显著的效应。例如，“Sapito”的根数大幅增加，“Mantequilla”的根长几乎翻倍。此外，生物量和光合色素的增加为这一阶段植物活力增强提供了有力证据。这些改善可归因于微生物产生的生长素，它们通过微囊化得到了更好的保存和输送。统计分析证实，这些反应受到基因型的强烈调节，支持使用GLMMs而非传统的ANOVA方法，因为GLMMs能考虑分层和非正态生物数据，同时纳入随机效应。豆类品种解释了很大比例的变异性，突出了基因型在与生物刺激剂相互作用中的核心作用。某些生长参数缺乏显著效应，这与先前报告一致，表明生物刺激剂可能不会均等地影响所有植物参数。
最终，这些早期的生理优势在大田条件下转化为了农艺性能的改善，三个品种的豆荚数、种子数、生物量和最终产量均有所提高。这项研究突显了基于EPS的复合微囊化系统在提高稳定性和田间表现方面的有效性，为在不断变化的世界中可持续提升豆类作物性能提供了一种有前景的策略。
