野生香蜂花亚种（Melissa officinalis subsp. altissima）的植物化学洞察与神经保护活性：从野生植物到功能性成分

《Food & Function》：From wild plant to functional ingredient: phytochemical insights and neuroprotective activity of Melissa officinalis subsp. altissima

本文系统研究了从法国科西嘉岛采集的野生香蜂花亚种（Melissa officinalis subsp. altissima），通过整合代谢组学、植物化学表征及生物学评价，首次全面解析了其水醇提取物和精油中的活性成分（如迷迭香酸、咖啡酸、绿原酸、β-石竹烯、吉马酮-D等），并揭示了其在抗氧化、抗炎及神经保护方面的显著功效。研究发现该提取物能有效对抗过氧化氢诱导的氧化应激、调节TNF-α、NOS-2、BDNF、IL-6和AChE等关键基因表达，为将其开发为具有抗氧化、神经保护和防腐特性的功能性食品及营养保健品提供了坚实的科学依据，凸显了本土芳香植物作为健康导向食品创新可持续资源的重要价值。

　　

¹.^引言

柠檬香蜂草，学名Melissa officinalis，是一种来自唇形科的多年生灌木状植物。其起源地虽未完全明确，但被认为原产于东地中海、西亚、南欧、高加索和伊朗北部。欧洲已鉴定出两个主要亚种：Melissa officinalis subsp. officinalis 和 Melissa officinalis subsp. altissima (Sm.)，二者可通过叶片的被毛和结果期花萼的形状加以区分。本研究所关注的Melissa officinalis subsp. altissima 也被称为野柠檬香蜂草或Melissa romana MILLER。唇形科家族是药用、芳香和食用植物的重要来源。柠檬香蜂草富含生物活性成分，包括萜烯、酚酸和黄酮类化合物，已被报道具有抗菌、抗真菌、抗病毒、抗炎和抗氧化等显著药理活性。

随着人们对健康生活方式和营养的偏好日益增长，天然功能性食品的消费量不断增加，植物及其衍生物在食品工业和营养保健品领域的应用显著扩大。欧洲药品管理局草药产品委员会基于传统用途，已批准使用柠檬香蜂草叶产品缓解轻度压力症状、辅助睡眠及治疗轻度消化系统疾病。此外，文献中还有研究讨论了这种药用植物对记忆形成和神经保护的潜在积极作用。特别是通过其主要多酚——迷迭香酸的作用机制，柠檬香蜂草似乎能够抑制β-淀粉样蛋白原纤维的形成。

在此框架下，旨在检测负责治疗效果的生物活性化学物质的植物代谢组学日益突出。植物的代谢组由具有不同理化性质的初级和次级代谢物组成，其中一些是物种特异性的。因此，尽可能多地收集有关芳香植物组成（以及由此提取的代谢物）、挥发性成分表征及其相关的生物学特性的信息至关重要。

本研究采用多方法分析方案，对来自科西嘉岛的野生香蜂花亚种进行了全面的代谢组学分析。特别是应用高分辨率核磁共振光谱研究了水醇和有机代谢物，并通过气相色谱-质谱联用技术分析了从植物营养部分获得的精油的化学成分。本研究旨在确定提取物和精油的植物化学成分与其各自的抗氧化和抗菌活性之间的关系，并通过生物学实验评估其对一般炎症和神经炎症的影响。

².^{材料与方法}

².¹. 植物材料

Melissa officinalis subsp. altissima的地上部分于2023年7月开花期在法国科西嘉岛中部采收，并根据Flora Corsica中总结的特征进行了植物学鉴定。

².². 化学试剂与材料

实验所用乙醇、甲醇、氯仿、乙醚等溶剂均为高效液相色谱级，购自默克公司。实验用水为Milli-Q Plus系统制备的双蒸水。用于核磁共振分析的氘代试剂购自Euriso-Top公司。用于生物学实验的试剂，如TRI reagent、PCR引物、TaqMan探针、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit、β-淀粉样蛋白等，均购自Sigma-Aldrich、Thermo Fisher Scientific或MedChemTronica等公司。

².³. 核磁共振分析

².³.¹. 提取程序

新鲜植物叶片经冷冻干燥并研磨成粉末后，采用Bligh-Dyer方案进行提取。使用甲醇/水混合物超声提取，然后用氯仿和水分配形成双相系统。离心后分离出水醇相和有机相，提取重复两次，合并提取物并在氮气下干燥。所有分析均进行三次重复。

².³.². 核磁共振实验

干燥的水醇相溶解于含有TSP内标的磷酸缓冲液/D₂O中，而氯仿干燥部分则重新溶解于CDCl₃/CD₃OD混合物中。核磁共振分析使用Jeol JNM-ECZ 600R仪器进行，质子频率为600.17 MHz。使用JEOL Delta软件进行谱图处理和信号积分。此外，还进行了二维实验，水醇和有机部分的定量遵循先前报道的实验方案。

².⁴. 气相色谱-质谱分析

².⁴.¹. 蒸馏与提取过程

植物地上部分风干后进行水蒸气蒸馏，使用Clevenger型装置，根据欧洲药典推荐的方法，蒸馏5小时，获得黄色精油，产率为0.04%。水馏液经过液-液萃取过程获得水馏液提取物，产率为0.06%。

².⁴.². 顶空固相微萃取条件

新鲜地上部分切碎后，使用DVB/CAR/PDMS涂层纤维进行顶空固相微萃取。

².⁴.³. 气相色谱-火焰离子化检测器分析

使用PerkinElmer Clarus 600系统进行气相色谱分析，配备两根不同极性的熔融石英毛细管柱。以氢气为载气，程序升温。

².⁴.⁴. 气相色谱-质谱分析

植物提取物使用PerkinElmer TurboMass四极杆检测器进行分析，与上述相同的两根色谱柱依次连接至同一质谱检测器。

².⁴.⁵. 化合物鉴定与定量

植物提取物中单个组分的鉴定基于气相色谱保留指数和电子轰击模式下的气相色谱-质谱数据。定量分析采用峰面积归一化法，包括相对于十三烷内标的火焰离子化检测器响应因子。

².⁵. 生物学实验

为了进行生物学实验，采用先前描述的绿色水醇提取方案制备提取物，以评估与植物复合物相关的生物效应。将干燥的水醇提取物溶解于DMSO/水的混合物中，制备成母液，并进一步稀释用于体外和离体实验。

².⁵.¹. 体外研究

使用大鼠下丘脑细胞进行生物相容性和抗氧化活性评估。通过MTT法评估细胞活力。将细胞接种在96孔板中，用不同浓度的野柠檬香蜂草水醇提取物处理过夜。在第二组实验中，细胞随后用300 μM过氧化氢处理3小时。通过测量540 nm处的吸光度来确定细胞存活率。使用GraphPad Prism软件进行单因素方差分析和Tukey多重比较检验。

².⁵.². 离体研究

使用成年C57/BL6小鼠的脑组织进行离体实验。动物饲养和实验程序严格遵循欧洲共同体伦理标准。通过二氧化碳吸入法处死动物获取脑组织。对于脂多糖刺激实验，取前额叶皮层和下丘脑切片，将其置于含有细菌脂多糖的培养板中。前额叶皮层样品用浓度为100和200 μg mL^-1的野柠檬香蜂草水醇提取物处理，下丘脑切片仅用200 μg mL^-1的最高浓度处理。

对于β-淀粉样蛋白刺激实验，获取前额叶皮层切片。样品分别用不同浓度的野柠檬香蜂草水醇提取物、以及用提取物处理后再用β-淀粉样蛋白刺激进行处理。

孵育4小时后，收集所有样品并储存在-80°C直至RNA提取。使用TRI reagent提取总RNA，并用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit进行反转录。通过基于TaqMan探针的定量实时PCR评估TNF-α、BDNF、NOS-2、IL-6和AChE的基因表达。使用GADPH作为内参基因。采用2^-ΔΔCt方法进行基因表达的相对定量。统计分析采用单因素方差分析，然后进行Tukey多重比较检验，以揭示各野柠檬香蜂草水醇提取物浓度与脂多糖或β-淀粉样蛋白刺激相比，基因表达的显著差异。

³.^{结果与讨论}

³.¹. 基于核磁共振的亲水性代谢物检测

通过一维和二维核磁共振实验，在水溶性野柠檬香蜂草提取物中鉴定并定量了多种代谢物。共鉴定出五类物质：五种糖类、一种多元醇、八种有机酸、十种氨基酸和四种多酚。具体包括：半乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖和菊粉；肌醇；乙酸、柠檬酸、乳酸、奎宁酸、甲酸、苹果酸、琥珀酸和酒石酸；丙氨酸、GABA、谷氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苏氨酸、酪氨酸和缬氨酸；以及咖啡鞣酸、绿原酸、咖啡酸和迷迭香酸。

³.¹.¹. 糖类

糖类是野柠檬香蜂草水提取物中检测到的最丰富的代谢物类别，其中蔗糖水平相对较高。这与之前的研究一致，表明蔗糖是Melissa officinalis中的主要糖分。本研究中葡萄糖、半乳糖、菊粉、果糖和肌醇的浓度与先前对officinalis亚种的研究报告一致。

³.¹.². 有机酸

野柠檬香蜂草中测量的有机酸总含量几乎是Melissa officinalis生态型中发现的一半。这与野生或较少驯化的植物物种的发现一致。苹果酸在水醇提取物中比栽培亚种更丰富。柠檬酸水平与先前研究中发现的山地生态型一致。最丰富的有机酸是酒石酸，其次是苹果酸和奎宁酸，而乳酸和乙酸的浓度最低。

³.¹.³. 氨基酸

氨基酸是野柠檬香蜂草提取物中含量最少的代谢物类别。其中，酪氨酸是水醇提取物中最普遍的氨基酸。支链氨基酸显示出不同的水平。与低地生态型和山地生态型相比，野柠檬香蜂草中异亮氨酸含量显著升高。苏氨酸和丙氨酸的浓度与低地和山地生态型相当。相比之下，野柠檬香蜂草中GABA的含量大约是栽培亚种的五分之一。相反，脯氨酸浓度在野柠檬香蜂草提取物中显著较高。

³.¹.⁴. 多酚

在野柠檬香蜂草的水醇提取物中鉴定出了咖啡酸、绿原酸、迷迭香酸和咖啡鞣酸。迷迭香酸是最丰富的多酚，浓度为1.352 mg/100 g干重。这种化合物以其强大的抗氧化和抗炎特性而闻名。绿原酸是第二主要的多酚化合物。在当前的调查中，咖啡酸和咖啡鞣酸的浓度超过了文献报道的值。

³.². 基于核磁共振的亲脂性代谢物检测

有机提取物中亲脂性代谢物的鉴定基于一维和二维核磁共振实验。定量分析显示，野柠檬香蜂草中总脂肪酸和不饱和脂肪酸的含量显著低于M. o. officinalis，而呈现出异常高比例的β-谷甾醇。在野柠檬香蜂草中未检测到豆甾醇。除了甾醇和脂肪酸，非靶向核磁共振分析还揭示了叶绿素和脱镁叶绿素的存在。野柠檬香蜂草的脂质谱显著减少。所有脂肪酸类别的检测水平都远低于officinalis亚种的报告值。总脂肪酸和总不饱和脂肪酸的含量分别约为officinalis生态型的十分之一和十八分之一。

³.³. 挥发性化合物的气相色谱-质谱分析

精油和挥发性成分的化学成分列表显示，在野柠檬香蜂草精油中鉴定出38种成分，占油的90.5%。在挥发性部分鉴定出28种成分。油的主要成分是碳氢化合物，其中吉马酮D是主要的倍半萜烯。主要油成分除了吉马酮D外，还有α-杜松醇、β-石竹烯和τ-杜松醇。

在通过HS-SPME分析的挥发性部分中，碳氢化合物占主导地位，占总成分的62.1%，其中单萜烯占37.8%。鉴定出的主要成分是(E)-β-罗勒烯和吉马酮D。还检测到含氧分子的存在，主要是具有相对较短直链的脂肪醛，包括异戊醛、己醛和2-甲基丁醛，这些在精油中未发现。

精油分析和挥发性成分分析之间在含氧和碳氢化合物方面观察到显著的定量和定性差异。

^{生物学实验结果}

^{体外细胞活力与抗氧化}

在基础条件下，野柠檬香蜂草水醇提取物在50–200 μg mL^-1浓度范围内对下丘脑细胞活力没有显著影响。在过氧化氢刺激下，所有测试浓度的野柠檬香蜂草提取物均能显著提高细胞活力，有效对抗过氧化氢诱导的氧化应激损伤。

^{离体基因表达调控}

在脂多糖刺激的小鼠皮层组织中，野柠檬香蜂草提取物能剂量依赖性地显著下调促炎因子TNF-α和NOS-2的基因表达，同时上调神经营养因子BDNF的表达。在下丘脑组织中，提取物也表现出类似的抗炎和神经营养调节作用。

在β-淀粉样蛋白刺激的小鼠皮层组织中，野柠檬香蜂草提取物能显著下调乙酰胆碱酯酶和促炎因子IL-6的基因表达。这表明提取物可能通过抑制乙酰胆碱降解和减轻神经炎症，在阿尔茨海默病等神经退行性疾病模型中发挥保护作用。

^{结论与展望}

本研究首次对野生香蜂花亚种进行了全面的代谢组学表征，系统鉴定了其水醇提取物和精油中的生物活性成分，包括高含量的迷迭香酸、绿原酸、β-谷甾醇以及以吉马酮D为主的挥发性化合物。生物学实验证实了该提取物具有显著的抗氧化、抗炎和神经保护活性，能够有效缓解氧化应激，并调节与神经炎症、神经营养和神经递质代谢相关的关键基因表达。

这些发现有力地支持了将野生香蜂花亚种开发为功能性食品和营养保健品中有价值的天然成分的潜力，其抗氧化、神经保护和防腐特性为开发支持大脑健康、预防神经退行性疾病的创新产品提供了科学依据。更重要的是，这项研究强调了本土芳香植物作为健康导向食品创新的可持续资源所具有的更广泛意义。未来的研究可进一步探索其活性成分的协同作用机制、体内功效验证以及其在特定食品体系中的应用稳定性，以加速其从野生植物向高效功能性成分的转化。