《Food & Function》：Persimmon by-products, rich in fibre, promote beneficial gut bacteria
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本研究深入探讨了柿子加工副产物中可溶性与不溶性膳食纤维组分，通过体外粪菌发酵模型，揭示了其选择性促进有益肠道菌属（如Bacteroides、Megasphaera、Oscillibacter等）生长、调节短链脂肪酸(SCFA)谱并显著提高吲哚-3-丙酸(IPA)等有益代谢物产量的能力。文章系统阐述了纤维组分结构（如阿拉伯糖、岩藻糖丰富的可溶性非淀粉多糖NSPs）与特定菌群调控之间的构效关系，以及多酚类物质在其中的作用，为开发靶向下一代益生菌的新型益生元功能食品原料提供了科学依据。
引言
柿（Diospyros kaki Thunb.）果实因其潜在的健康益处而日益受到欢迎，全球年产量超过400万吨。在加工过程中，约20-30%的果实质量（主要为果皮和果肉纤维）被作为副产物丢弃。这些副产物富含膳食纤维（尤其是不溶性组分）和大量结合态多酚，符合循环经济原则，是开发增值产品的理想资源。膳食纤维是人体营养的基本组成部分，分为可溶性和不溶性两类，均对肠道健康、代谢调节和慢性病预防至关重要。然而，许多人群的膳食纤维摄入量仍低于推荐水平。结肠细菌发酵膳食纤维产生短链脂肪酸（SCFAs），如乙酸、丙酸和丁酸，在维持肠道屏障完整性、调节免疫反应和减轻炎症方面发挥关键作用。柿子副产物中的纤维基质与多酚（如没食子酸、原儿茶酸、飞燕草素和矢车菊素）之间存在相互作用，这种结合可保护多酚在上消化道免于过早降解，延迟其至结肠释放，从而发挥局部抗炎和抗氧化作用，并选择性抑制病原菌、促进有益菌生长。本研究旨在探究高纤维柿子组分（Rojo Brillante品种）与健康人粪便微生物群共培养时的发酵特性，明确其结构-活性关系，为促进柿子富纤维副产物作为新型益生元开发来源提供关键信息。
材料与方法
研究使用了西班牙当地市场购得的鲜柿（Rojo Brillante品种）。果实经加工分离果汁和固体副产物（果肉和果皮）。部分副产物悬浮液接种Streptococcus salivarius subsp. thermophilus CECT 7207和Lactobacillus casei CECT 475，在37°C发酵24小时，旨在减少游离糖含量并增加非淀粉多糖（NSP）组分中非提取性植物化学物质的生物可及性。所有批次（未处理和发酵处理）的副产物均经过碱处理和酸处理水解，分别冻干得到红色未处理/发酵的可溶性及不溶性组分。
采用气相色谱分析了可溶性与不溶性非淀粉多糖（NSP）的组成。通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）和高效液相色谱（HPLC）对柿子组分中的各类植物化学物质（如简单酚、苯甲酸、花青素等）进行了定性和定量分析。游离糖组成通过配备示差检测器的HPLC进行分析。
体外粪菌发酵实验使用了四名健康志愿者的粪便样本制备混合微生物群。将柿子组分在厌氧条件下与粪便浆液共同孵育24小时，并设置了仅培养基加粪便浆液、仅培养基加柿子基质等多种对照。在孵育0小时和24小时时取样，用于短链脂肪酸（SCFA）分析、DNA提取和微生物代谢物分析。SCFA浓度通过气相色谱法测定。微生物代谢物通过LC-MS/MS分析。使用试剂盒提取总DNA，并对细菌16S rRNA基因的V1-V2区进行扩增子测序。序列经过质量过滤和处理，使用SILVA 138数据库进行聚类和分类学分析。使用多种生物信息学和统计方法（如ANCOM、LEfSe、alpha/beta多样性分析、相关性网络等）分析了微生物群落数据、SCFA数据及植物化学物质数据。
结果
柿子组分的表征
获得了可能发挥微生物群调节作用的新型柿子组分。可溶性非淀粉多糖（NSP）占未处理和发酵产品的比例分别为2.64%和2.17%，富含糖醛酸、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。不溶性组分中，可溶性NSP占约1.34%，其甘露糖和葡萄糖含量高于可溶性组分。不溶性NSP占未处理和发酵产品的比例分别为38.18%和36.18%，葡萄糖和木糖是其主要单糖。正如预期，可溶性组分中游离葡萄糖和果糖的含量高于不溶性组分。
植物化学分析表明，未处理可溶性组分的主要成分是没食子酸、飞燕草素和原儿茶酸。发酵处理可显著增加可溶性组分中飞燕草素和矢车菊素的含量。矢车菊素是未处理不溶性组分中最丰富的化合物，而发酵处理显著增加了不溶性组分中的飞燕草素含量。发酵处理显著增加了以游离形式（EPP）和结合形式（NEPP）存在的分子的可提取性，对可溶性组分的影响大于不溶性组分。主成分分析（PCA）显示，代谢物谱在发酵后发生改变，尤其是可溶性组分中游离形式可提取的分子。
柿子组分的微生物群调节作用
通过粪便发酵实验研究了可溶性和不溶性柿子纤维组分的微生物群调节特性。α多样性分析显示供体间存在差异。β多样性分析表明，不同组间微生物多样性无显著差异，这可能归因于发酵谱的个体间差异。主坐标分析（PCoA）显示，相同供体和相同发酵时间的样本聚集在一起，突出了个体间差异在微生物群组成谱中的作用，同时也区分了不同的底物组。微生物组成条形图揭示了供体和底物间多个菌属丰度的主要差异。
统计分析发现，在柿子样品粪便微生物发酵24小时后，共有六个微生物属的读数计数和丰度出现统计学显著增加，且这些类群在对照样本中并未增加。其中，经预处理的不溶性纤维组分选择性促进了供体4和2微生物群中的Bacteroides增长。类似地，未处理的不溶性组分选择性促进了供体4微生物群中的Megasphaera增长。另一方面，预处理的可溶性组分增强了所有供体中Lachnospiraceae UCG-010以及供体2中Anaerovoraceae family XIII AD3011 group的生长。Oscillibacter的促进作用选择性较低，在多种底物发酵后于多个供体中均有增加。
相关性网络分析揭示了受柿子组分调控的微生物类群与其他肠道共生菌之间的潜在相互作用。主要观察到两组细菌：第一组，Megasphaera与Lachnospira和新的梭菌类群呈正相关；第二组，Anaerovoraceae family XIII AD3011 group和Lachnospiraceae UCG-010与Coprococcus、Eubacterium ruminatum group和Rikenellaceae RC9 groups呈正相关。第一组细菌更多被未处理不溶性组分促进，而第二组也受发酵处理的可溶性组分调控。
原料组成对柿子发酵谱的影响
为明确具有微生物群调节作用的柿子组分的构效关系，研究了原料组成对发酵谱的影响。可溶性NSP中阿拉伯糖和岩藻糖水平与Oscillibacter呈正相关，与半乳糖和糖醛酸呈负相关。Anaerovoraceae family XIII AD3011 group则表现出相反的趋势。类似地，Megasphaera和Anaerovoraceae family XIII AD3011 group分别与不溶性NSP组分呈正相关和负相关。
原料植物化学组成与受柿子促进的微生物类群之间的关联也被确定。Anaerovoraceae family XIII AD3011 group与多种植物化学物质呈正相关，包括苯乙酮、苯、苯甲酸、肉桂酸和苯丙酸类物质，而与黄烷类/香豆素类及木脂素类呈负相关。Megasphaera和Oscillibacter则表现出相反的行为模式。
微生物代谢物谱
进一步分析了短链脂肪酸（SCFA）的产生和植物化学物质的转化。在所有发酵实验中，乙酸、丁酸、丙酸和戊酸水平在24小时均显著增加，不同底物间无显著差异。相比之下，乳酸仅在未处理的可溶性组分中增加。值得注意的是，Megasphaera增加最显著的样本也显示出多种SCFAs的增加。相关性分析发现原料中的不溶性NSP与异丁酸和异戊酸的产生呈正相关，可溶性NSP与乳酸水平也呈正相关。
主成分分析（PCA）揭示了可溶性与不溶性组分在发酵24小时后的代谢物谱存在明显分离，反映了微生物活动诱导的显著代谢转变。其中，4-羟基扁桃酸和苯乳酸主要驱动不溶性纤维组分的分离，而2-羟基苯丙酸、3,4-二羟基苯丙酸、4-乙基苯酚和吲哚-3-羧酸等化合物则主要导致可溶性纤维组分在微生物发酵后的分离。特别值得注意的是，可溶性柿子组分在粪便发酵后产生的吲哚-3-丙酸（IPA）量显著高于不溶性组分。
讨论
本研究成功证明了食品工业中不同柿子副产物组分的微生物群调节特性。用于获得柿子组分的处理显著影响了其碳水化合物组成，特别是NSP的谱图。所有游离葡萄糖和果糖在发酵过程中被耗尽，表明简单糖被微生物快速利用。虽然NSP总量保持不变，但单糖组成发生显著改变，这些组成变化至关重要，因为膳食纤维的结构和单糖构成直接影响其发酵性和产生的SCFA谱。可溶性NSP总量与乳酸水平呈正相关，而可溶性NSP中的阿拉伯糖和甘露糖含量与异丁酸和异戊酸增加相关。不溶性NSP总量也与这些支链脂肪酸呈正相关。
对柿子富纤维组分施加的发酵处理也显著影响了植物化学物质的可提取性和分布，显著增加了可提取多酚（EPP）和不可提取多酚（NEPP）的含量。最明显的增加出现在可溶性组分中的矢车菊素、飞燕草素、原儿茶酸和没食子酸，以及不溶性组分中的矢车菊素、飞燕草素、没食子酸和天竺葵素。NEPP的意外增加可能是由于微生物生物转化途径不仅在发酵过程中释放酚类物质，还可能通过次级结合或缩合反应重新结合或聚合酚类中间体，从而产生新的结合态酚类结构。
柿子组分的微生物群调节特性也得到了研究。微生物增加最显著的是Bacteroides属，其被预处理的不溶性纤维组分选择性调节。Bacteroides是主要的通用共生菌和潜在有益菌群，能够利用多种植物碳水化合物。其他被柿子组分选择性促进的潜在益生菌包括Megasphaera（一种已知的乳酸利用菌，可将乳酸转化为乙酸和丙酸）、Oscillibacter（可产生丁酸等SCFA并可能发挥抗炎活性）、Lachnospiraceae成员、Dialister以及Anaerovoraceae family XIII的成员。这些类群中包含重要的SCFA生产者和下一代益生菌，并显示出与其他微生物群成员广泛的统计关联。
柿子底物的构效关系表明，富含阿拉伯糖和岩藻糖的可溶性NSP促进Oscillibacter，而不溶性NSP促进Megasphaera。同样，酚类化合物组成对柿子组分的发酵特性也有很大影响，突出了黄酮类、苯甲酸和苯乙酸的作用。研究还证明，可溶性柿子组分的粪便发酵导致吲哚-3-丙酸（IPA）的产量显著高于不溶性组分。鉴于IPA已确定的抗氧化、抗炎和神经保护特性，这一发现强调了在饮食中加入富含可溶性纤维的柿子副产物的潜在健康益处。
结论
研究表明，通过加工对柿子NSP进行结构修饰不仅改变了其单糖组成，还调节了其发酵性和代谢输出。这些变化对开发针对肠道健康的功能性成分具有重要意义，特别是通过选择性刺激产生SCFA和抗炎的微生物类群。发酵处理后EPP和NEPP含量的增加可能是酶解释放、微生物生物转化和次级结合反应共同作用的结果。这些发现验证了发酵作为提高柿子副产物营养和功能价值的战略工具的有效性，支持其在针对代谢和肠道健康的功能食品开发中的应用。
柿子可溶性和不溶性纤维组分的微生物群调节特性已被确定。预处理的不溶性组分选择性促进Bacteroides的生长，而未处理的不溶性组分刺激Megasphaera的生长。另一方面，预处理的可溶性组分增强了Lachnospiraceae UCG-010和Anaerovoraceae family XIII AD3011的生长。可溶性和不溶性组分调节了Oscillibacter的生长。其中一些类群包括重要的SCFA生产者和下一代益生菌，它们与微生物群的其他成员表现出广泛的统计关联。此外，还确定了柿子组分的构效关系。在这方面，富含阿拉伯糖和岩藻糖的可溶性NSP促进Oscillibacter，而不溶性NSP刺激Megasphaera的生长。同样，酚类化合物组成对柿子组分的发酵特性有很大影响，突出了黄酮类、苯甲酸和苯乙酸的作用。柿子副产物是潜在益生元底物的有前途来源，可能对设计具有增强选择性、靶向下一代益生菌的新型益生元配方具有特殊意义。
本研究还表明，与不溶性组分相比，可溶性柿子组分的粪便发酵导致吲哚-3-丙酸（IPA）的产量显著更高。鉴于IPA已确定的抗氧化、抗炎和神经保护特性，这一发现强调了在饮食中加入富含可溶性纤维的柿子副产物的潜在健康益处。这些结果与之前的证据一致，即可溶性纤维更易发酵，并能产生支持肠道和全身健康的有益代谢物。未来的研究应探索可溶性纤维发酵与IPA生物合成之间的机制途径，并评估其对代谢和神经退行性疾病预防的意义。
