《Journal of Advanced Research》：TCF4 intronic CAG repeat length modulates the effect of
ATXN3 on age at onset in spinocerebellar ataxia type 3
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本研究为解析脊髓小脑共济失调3型（SCA3）发病年龄的巨大个体差异，针对转录因子4（TCF4）内含子的CAG重复序列是否可作为遗传修饰因子展开探索。通过大规模临床队列（1，439名中国SCA3个体）的回归与生存分析，并结合细胞模型的分子功能验证，研究证实TCF4内含子重复长度以剂量依赖方式双向调控致病性ataxin-3蛋白的作用，显著揭示了非编码重复与编码重复之间协同致病的全新修饰机制。
脊髓小脑共济失调3型（Spinocerebellar ataxia type 3， SCA3），又名马查多-约瑟夫病（Machado-Joseph disease），是全球范围内最常见的常染色体显性遗传性共济失调。该病由ATXN3基因编码区内的CAG三核苷酸重复序列异常扩增所致，这种扩增导致其编码的ataxin-3蛋白中多聚谷氨酰胺（polyglutamine）链异常延长，进而驱动小脑和脑干等特定脑区的选择性神经元变性。患者通常在人生的黄金时期——二三十岁至五六十岁之间发病，临床表现为进行性的行走不稳、眼球运动障碍、锥体束征和锥体外系症状，严重影响生活质量。
尽管ATXN3基因中扩增的CAG重复长度是决定发病年龄（Age at Onset, AO）最主要的因素，但其解释力有限，仅能解释约50%至70%的AO变异。这意味着，对于携带相同长度CAG重复序列的患者，他们的发病时间仍可能存在显著差异。这种巨大的“剩余变异性”背后，潜藏着其他遗传修饰因子（genetic modifier）的影响。以往的研究已经鉴定出数个位于蛋白质编码区的、携带CAG重复的基因（如ATXN2， KCNN3等）可作为SCA3的修饰因子。然而，仍有大量变异来源不明，特别是位于基因非编码区域的重复序列是否也扮演着角色，仍是一个待解的谜题。
这项发表在《Journal of Advanced Research》上的研究，将目光投向了转录因子4（Transcription Factor 4， TCF4）基因。TCF4不仅在SCA3易损的脑区（如小脑、脑干）高表达，其第三个内含子中还含有一段多态性的CTG·CAG重复序列。有趣的是，该重复序列的扩增（通常≥40次）是导致一种常见眼科疾病——Fuchs角膜内皮营养不良（FECD）的显著风险因素。那么，这段位于内含子中的“沉默”重复，是否也会“跨界”影响SCA3的疾病进程呢？为了回答这个科学问题，研究团队展开了一项结合大规模临床遗传学分析与深入分子机制探索的综合研究。
研究人员为开展此项研究，主要运用了以下几个关键技术方法：首先，他们构建了一个大规模的、分子确诊的中国SCA3人群横断面研究队列，共纳入1439名个体（包括1212名症状患者和227名无症状携带者），通过荧光PCR和毛细管电泳技术精确测定ATXN3和TCF4基因的CAG重复长度。其次，在统计分析方面，采用了两阶段框架：针对症状患者进行层级线性回归分析，并纳入全队列（包括无症状者）进行参数化加速失效时间（AFT）生存模型分析，辅以广泛的敏感性检验和交叉验证以确保结果的稳健性。最后，在功能验证层面，他们建立了稳定表达正常（20Q）或致病性（84Q）ataxin-3蛋白的HEK293T细胞系，通过转染携带不同长度（11， 24， 100）内含子CTG重复的TCF4表达构建体，利用免疫共沉淀、RT-qPCR、RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）和免疫荧光等技术，探究TCF4与ataxin-3之间的物理相互作用和功能上的双向协同效应。
研究结果
人口统计学和临床特征
研究队列由1439名基因确诊的SCA3个体组成，包括1212名症状患者和227名无症状携带者。症状患者的平均发病年龄为35.6岁。根据较长等位基因的重复次数，TCF4 CAG重复被分为三组：短（7–13次）、中（14–39次）和长（≥40次）。长重复组（FECD的风险阈值）约占队列的4.5%，各组在症状患者与无症状携带者间的分布相似。
层级线性回归揭示TCF4对ATXN3效应的修饰作用
回归分析表明，TCF4分组本身对发病年龄无直接独立影响，但能显著调节ATXN3 CAG重复长度与发病年龄之间的关系。在纳入交互项的模型中，ATXN3扩增CAG重复长度与TCF4中、长分组之间的交互作用系数均为显著负值，表明模型拟合度显著提升。这意味着，TCF4是通过调节ATXN3的主效应来发挥作用的，而非独立决定发病年龄。
TCF4 CAG重复长度以剂量依赖方式增强ATXN3效应及预测力
简单斜率分析显示，ATXN3扩增CAG重复对发病年龄的负向效应（即每增加一个重复，发病年龄提前的年数）在TCF4短、中、长组中依次增强，分别为-2.04、-2.60和-3.18年/重复。同时，ATXN3对发病年龄变异的解释力（调整后R2）也随TCF4重复长度增加而显著上升，从短组的0.51增至长组的0.76，呈现明显的剂量依赖性增强模式。
年龄依赖性的TCF4修饰效应在早发患者中尤为显著
当按发病年龄将患者分层为早发（≤25岁）、中发（26–40岁）和晚发（>40岁）组时，TCF4的修饰效应表现出明显的年龄依赖性。仅在早发患者组中，纳入TCF4-ATXN3交互项能显著提升模型解释的方差（Δ调整后R2= 0.048），且中、长TCF4组的负向交互作用系数均达到统计学显著。分位数回归结果进一步证实，显著的负向交互作用主要集中于发病年龄分布的低百分位数（即更早发的部分）。
生存分析验证了长度依赖性的TCF4修饰效应
由于Cox比例风险模型存在比例风险假设违例，研究采用参数化加速失效时间（AFT）模型作为主要生存分析策略。在所有评估的分布中，逻辑斯蒂AFT模型拟合最佳，并一致验证了TCF4中、长分组与ATXN3重复长度之间存在显著负向交互作用，即TCF4重复越长，ATXN3重复对疾病“风险”（表现为时间加速）的效应越强。
生物信息学分析和双向致病协同性的功能验证
生物信息学分析显示，TCF4与ATXN3在SCA3相关脑区（如小脑半球、脊髓）存在强共表达，并共享大量的microRNA靶点和RNA结合蛋白，提示在转录后调控层面存在潜在交互。
细胞实验进一步揭示了其分子基础：
- 1.
物理相互作用：免疫荧光和免疫共沉淀实验证实，TCF4与ataxin-3蛋白存在直接物理相互作用，且在致病性ataxin-3（84Q）背景下，两者的共定位程度更高。
- 2.
扩增的ataxin-3加剧TCF4功能紊乱：在携带致病性ataxin-3（84Q）的细胞中，转染含有长CTG重复（100次）的TCF4内含子表达载体，会协同性地加剧TCF4 pre-mRNA的剪接缺陷、导致正确剪接的TCF4 mRNA减少及蛋白水平下降，并促进核内RNA foci的形成。
- 3.
扩增的TCF4加剧突变ataxin-3聚集：反之，长CTG重复的TCF4表达能显著促进致病性ataxin-3（84Q）蛋白的聚集形成，而在正常ataxin-3（20Q）背景下则无此效应。
- 4.
无直接转录调控：双荧光素酶报告基因实验表明，TCF4并不直接激活ATXN3的启动子。
结论与讨论
本研究通过大规模临床队列和深入的分子机制探索，首次鉴定出TCF4是SCA3发病年龄的一个新型遗传修饰因子。其核心发现在于：TCF4内含子的CAG重复长度以剂量依赖的方式，修饰（主要是增强）ATXN3扩增等位基因的致病效应，且这种修饰作用在早发患者中最为显著。这一遗传学发现的背后，是TCF4与ataxin-3之间建立的双向致病协同作用：一方面，扩增的致病性ataxin-3蛋白会加剧TCF4因内含子重复扩增导致的RNA剪接缺陷、蛋白表达减少和RNA毒性；另一方面，扩增的TCF4内含子重复又会反过来促进突变ataxin-3的聚集。这种蛋白质介导的毒性与RNA介导的毒性之间的恶性循环，为理解SCA3的表型变异提供了全新的分子机制框架。
这项研究的重要意义体现在多个层面：首先，它极大地拓展了我们对SCA3乃至多聚谷氨酰胺疾病遗传修饰格局的认识，首次将一个位于内含子的非编码重复序列确立为强有力的修饰因子，揭示了非编码变异在复杂疾病表现中的关键作用。其次，研究所阐明的TCF4-ataxin-3双向协同机制，为开发针对这一特定致病轴线的治疗策略（如靶向纠正剪接、降低RNA毒性或破坏异常蛋白相互作用）提供了新的潜在靶点。尽管将TCF4基因型纳入模型对个体层面的发病年龄预测精度提升有限，这符合多基因修饰的复杂架构特点，但其对于识别高危亚群（如早发患者）、优化临床试验的患者分层以及未来构建更精准的多基因风险评分模型，都具有不可或缺的价值。最后，TCF4作为FECD的致病基因，在SCA3患者中却未引发角膜病变，这一现象凸显了其致病效应的组织特异性与上下文依赖性，即其修饰功能的完全显现需要致病性ataxin-3蛋白共存所创造的特定细胞环境，深化了我们对基因多效性及疾病特异病理机制的理解。总之，该研究不仅为SCA3的精准预后和临床管理增添了新的遗传学工具，更照亮了探索重复扩增疾病中编码与非编码区域互作这一充满前景的新方向。
