《Journal of Advanced Research》：Gestational low carbamoyl phosphate suppresses TET2-mediated DNA demethylation and induces congenital heart disease in offspring
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本研究聚焦于干细胞衰老在机体老化及年龄相关疾病中的作用。研究人员从传统中药茯苓中筛选出活性三萜类化合物茯苓酸，通过体外干细胞衰老模型发现其可特异性靶向PDIA6，解除其对G6PD的抑制，进而激活G6PD/STAT3信号轴，有效延缓人间充质干细胞（hMSC）衰老。在老年性骨质疏松（SOP）小鼠模型中，茯苓酸通过延缓骨髓间充质干细胞（BMSC）衰老，显著改善了骨微结构和骨代谢，为靶向干细胞衰老治疗年龄相关骨骼疾病提供了新的药物先导和科学依据。
随着年龄增长，我们的身体会像机器一样逐渐磨损，功能下降，这个过程被称为衰老。衰老不仅是外表的变化，更深层次地，它会伴随多种与年龄相关的疾病，如癌症、心血管疾病和退行性疾病。其中，干细胞（一种具有自我更新和多向分化潜能的细胞）的衰老及其后续的耗竭，被认为是组织再生能力下降和机体衰老的主要驱动力。那么，能否通过延缓干细胞衰老来对抗衰老和老年病呢？这是一个极具前景的研究方向。传统药物干预衰老的研究在过去20年取得了长足进展，然而，以干细胞为靶点的抗衰老药物干预策略却鲜有报道。另一方面，拥有两千多年应用历史的传统中药茯苓，因其健康促进和延年益寿的功效而闻名，但其抗衰老的活性成分和作用机制尚不明确。为了破解这些谜题，并为开发靶向干细胞衰老的新型抗衰老药物提供线索，研究人员在《Journal of Advanced Research》上发表了一项研究，聚焦于茯苓中的一种三萜化合物——茯苓酸（PA），系统地探索了其在延缓干细胞衰老和治疗老年性骨质疏松（SOP）中的作用与机制。
为了开展这项研究，研究者们采用了多项关键技术。他们首先从健康孕妇的羊膜组织中分离并培养了人间充质干细胞（hMSC），并利用过氧化氢（H2O2）诱导建立了hMSC的氧化应激衰老模型，用于筛选和验证茯苓酸的抗衰老活性。在机制探索方面，研究运用了药物亲和响应靶稳定性（DARTS）和细胞热位移分析（CETSA）技术，成功鉴定出茯苓酸的直接作用靶点为蛋白质二硫键异构酶家族A成员6（PDIA6）。通过分子对接预测了茯苓酸与PDIA6的结合位点，并利用定点突变技术进行了功能验证。此外，研究还使用了基因敲低（shRNA）和过表达技术，结合蛋白质免疫印迹（Western blot）、免疫共沉淀（Co-IP）、实时荧光定量PCR等分子生物学方法，深入解析了PDIA6/G6PD/STAT3信号轴的调控关系。在动物水平，研究选用了自发性的老年性骨质疏松模型小鼠（SAMP6）来评估茯苓酸的体内疗效，并通过微计算机断层扫描（μCT）、酶联免疫吸附测定（ELISA）以及从模型小鼠骨髓中分离培养骨髓间充质干细胞（BMSC）等方法，综合分析了药物对骨微观结构、血清生化指标及干细胞功能的影响。
结果
PA对hMSC衰老具有显著的保护作用
在H2O2诱导的hMSC衰老模型中，研究人员发现茯苓酸能够以剂量依赖的方式显著减少衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）阳性细胞的数量，最佳有效浓度为1 nM，且在此浓度下无细胞毒性。进一步的实验表明，茯苓酸处理缓解了G2/M期细胞周期阻滞，下调了衰老标志物p21和p16的蛋白表达，减少了细胞内活性氧（ROS）的积累。同时，茯苓酸增强了衰老hMSC的自我更新能力（表现为集落形成增加和增殖细胞核抗原PCNA表达上调）、多能性（表现为Nanog、SOX2和OCT4表达上调）以及成骨和成软骨分化潜能。这些数据表明，茯苓酸能够有效延缓hMSC的衰老。
PA通过JAK2/STAT3通路延缓hMSC衰老
为了探究茯苓酸的作用通路，研究人员检测了多条与衰老相关的信号通路。结果发现，茯苓酸处理上调了JAK2和STAT3的mRNA水平及其磷酸化蛋白（p-JAK2和p-STAT3）水平，提示JAK2/STAT3通路被激活。当使用JAK2/STAT3通路选择性抑制剂AG490阻断该通路后，茯苓酸的抗衰老效应被显著削弱，表现为SA-β-Gal阳性细胞比例和ROS积累增加，而集落形成能力、多能性因子表达及分化潜能均下降。这证实茯苓酸是通过激活JAK2/STAT3信号通路来发挥其保护作用的。
PA通过结合PDIA6并抑制其活性，从而激活G6PD/STAT3信号来延缓hMSC衰老
为了找到茯苓酸作用的直接靶点，研究者们运用了DARTS联合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，初步筛选出PDIA6和G6PD作为候选靶蛋白。随后的验证实验（DARTS和CETSA）显示，茯苓酸能够特异性地与PDIA6结合，增加其对酶解和热变性的稳定性，但并未与G6PD发生直接结合。功能实验发现，敲低G6PD会加剧细胞衰老，而敲低PDIA6则会上调G6PD和p-STAT3的水平，但不影响细胞衰老表型；相反，过表达PDIA6会抑制G6PD和p-STAT3的表达，并促进细胞衰老，而茯苓酸处理可以逆转这些效应。进一步的机制研究表明，PDIA6和G6PD之间没有直接的蛋白相互作用，但PDIA6对G6PD的表达具有抑制作用。综合来看，茯苓酸通过特异性靶向PDIA6，解除了PDIA6对G6PD的抑制，从而激活了下游的G6PD/STAT3信号轴，最终延缓hMSC衰老。
PA通过与PDIA6的D221和T166位点结合来激活G6PD/STAT3信号轴
通过分子对接，研究人员预测了茯苓酸可能与PDIA6蛋白的N39、I40、N109、T166、D221、V224等氨基酸残基结合。随后的氨基酸定点突变结合DARTS实验验证发现，当T166或D221位点发生突变时，茯苓酸与PDIA6的结合被破坏。功能上，在这两个关键位点突变存在的情况下，茯苓酸提升G6PD和p-STAT3蛋白表达、降低ROS积累和p21表达、减少SA-β-Gal阳性细胞、以及促进PCNA和多能性因子表达的能力均被消除。这表明茯苓酸正是通过结合PDIA6蛋白的T166和D221位点来发挥其抗衰老作用的。
PA改善了SAMP6小鼠的老年性骨质疏松
在动物实验中，研究人员使用了自发老年性骨质疏松模型SAMP6小鼠。给予不同剂量的茯苓酸口服治疗四周后，小鼠血清中的衰老生物标志物丙二醛（MDA）和晚期糖基化终末产物（AGE）水平显著降低，而睾酮（T）水平升高。同时，茯苓酸治疗显著提升了成骨标志物骨钙素（BGP）和I型前胶原氨基端前肽（PINP）的血清水平，降低了骨吸收标志物抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）和I型胶原交联C-末端肽（CTX1）的水平。μCT扫描和骨组织形态计量学分析显示，茯苓酸有效改善了SAMP6小鼠股骨远端的骨微结构，增加了骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和厚度（Tb.Th），并减少了骨小梁分离度（Tb.Sp）。组织病理学切片也证实了骨微观结构的改善，且未观察到明显的肝、肾毒性。这些结果表明，茯苓酸能够有效缓解SOP小鼠的衰老表型并改善骨质疏松。
PA通过PDIA6/G6PD/STAT3信号轴延缓SAMP6小鼠的BMSC衰老
骨髓间充质干细胞（BMSC）的衰老与SOP的发生密切相关。研究人员从经茯苓酸治疗的SAMP6小鼠骨髓中分离出BMSC进行离体分析。结果发现，与模型组相比，茯苓酸治疗组的BMSC衰老表型得到显著改善：G2/M期细胞周期阻滞被逆转，细胞活力增强，ROS积累和SA-β-Gal阳性细胞比例减少，衰老标志物p21表达下调。更重要的是，这些BMSC的成骨和成软骨分化能力也得到恢复。在机制上，茯苓酸处理上调了BMSC中G6PD和p-STAT3的蛋白表达，而对PDIA6的表达没有影响。这与体外hMSC的实验结果一致，表明茯苓酸在体内同样通过PDIA6/G6PD/STAT3信号轴来延缓BMSC衰老，从而发挥抗SOP的作用。
结论与讨论
本研究成功地从传统中药茯苓中鉴定出三萜类化合物茯苓酸（PA），其在体外和体内均表现出抗衰老活性。研究首次阐明，茯苓酸通过特异性结合蛋白质二硫键异构酶A6（PDIA6）的D221和T166位点，解除PDIA6对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）的抑制，进而激活G6PD/STAT3信号轴，从而有效延缓人间充质干细胞（hMSC）的衰老。在自发性老年性骨质疏松（SOP）模型小鼠（SAMP6）中，茯苓酸通过同样的信号通路延缓了骨髓间充质干细胞（BMSC）的衰老，改善了骨代谢失衡和骨微结构破坏，展现出良好的治疗潜力。
这项研究的意义重大。首先，它验证了基于干细胞衰老模型筛选抗衰老药物的可行性，为从天然产物库中快速发现活性先导化合物提供了有效策略。其次，研究首次揭示了PDIA6在调控干细胞衰老中的新功能，以及茯苓酸通过靶向PDIA6-G6PD-STAT3这一全新信号轴发挥作用的分子机制，深化了对干细胞衰老调控网络的认识。第三，研究不仅停留在细胞层面，更在生理相关的疾病模型（SOP）中证实了茯苓酸的疗效，完成了从靶点发现、机制阐释到体内验证的完整证据链，为其后续开发成为抗SOP的候选药物奠定了坚实的科学基础。最后，该工作为利用传统中药宝库开发靶向干细胞衰老的新型抗衰老疗法提供了一个成功范例，彰显了中西医结合在应对老龄化挑战中的巨大潜力。尽管研究在JAK2激活的独立机制、PDIA6调控G6PD的中间环节等方面仍有待深入，但其系统性的研究范式和创新性的发现，为对抗衰老及相关疾病开辟了新的药物研发思路和干预靶点。
