《Advanced NanoBiomed Research》：Fast-Track to Functional Neurons: Accessible and Minimalistic Neurogenin 2 Programming of Human iPSCs
编辑推荐：
本文推荐一篇高效创新的神经分化方法综述。作者提出并验证了“集落启动分化”（CID）策略，利用商业化携带多西环素诱导神经源素2（NGN2）表达盒的人诱导多能干细胞（hiPSC）系，仅需五天即可在无饲养细胞和生长因子的条件下获得功能性神经元。该方法操作简单、耗时短、重现性高，为跨学科领域的神经研究和应用（如毒性筛选、药物发现及神经-材料界面研究）提供了一个强大且易于使用的平台。
Abstract
神经科学研究与治疗应用的核心支柱之一，是利用人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）进行神经元分化。然而，传统的分化方案通常资源密集、技术复杂且耗时漫长，往往需要数周乃至数月才能获得功能性神经元。本研究提出了一种精简的方法，通过引入“集落启动分化”（colony-initiated differentiation， CID）策略，实现了快速、可靠的神经源素2（neurogenin 2， NGN2）介导的神经元分化。CID方法使用一种商业化的人iPSC细胞系（BIONi010-C-13，该细胞系携带有四环素（doxycycline， DOX）诱导的NGN2表达盒），仅需五天即可获得功能性神经元。在CID过程的前两天，细胞集落发生结构重组，随后细胞被重新铺板并继续培养3至5天以成熟。从第5天起，通过膜片钳记录到动作电位（action potentials， APs），证明神经元已具有功能。至关重要的是，CID过程完全不需要饲养细胞和生长因子。该方法的简单性、与常规工作日的兼容性，以及使用市售人iPSC细胞系获得的分化质量，使其易于被不同领域的研究人员所采用。因此，这项工作不仅对加速毒性筛选和药物发现领域的研究具有重要意义，特别是在材料科学和生物工程等多学科交叉领域，为研究神经元-材料界面和相互作用提供了一个稳健的平台。
1 引言
人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的神经元已成为神经科学和生物医学研究中的变革性工具。这些来自患者的神经元为研究人类特异性神经发育、疾病建模和进行高通量药物筛选提供了一个无与伦比的平台。已发表的各种分化方案提供了前所未有的神经元类型多样性，以满足神经学研究中的特定需求。尽管这种多样性是一种优势，但也带来了重大挑战：许多方案技术要求高，需要较长的培养周期，或依赖生长因子和饲养细胞的复杂组合。所有这些因素都可能影响重现性、限制可扩展性，并阻碍在多学科环境中（如材料科学、生物电子学、生物医学工程和纳米技术为基础的再生医学领域）的便捷应用。因此，迫切需要简化和快速的分化方法，在明确且易于获取的条件下生成功能性神经元，以促进hiPSC来源的神经元在经典生物学实验室之外的非专业领域得到应用，并克服现有复杂分化程序的“高门槛”问题。
2 结果
分化程序总计持续7天（DIV），并包括在第2天（DIV）进行的一次重新铺板步骤。简而言之，含有DOX诱导的NGN2表达盒的hiPSCs每周进行传代（-5 DIV），通过在mTeSR+培养基中添加DOX来激活NGN2过表达，从而从培养五天的细胞集落启动神经元分化（0 DIV）。在第1天，将mTeSR+培养基更换为补充了DOX的N2B27+培养基。在第2天（CID阶段结束时），将细胞集落解离并铺到新的孔板上，同时仍使用补充了DOX的N2B27+培养基（不需要ROCK抑制剂）。细胞在这些条件下总共维持培养7天，而第一批神经元在第5天或之后变得具有功能。
未分化的细胞集落显示出紧密的细胞生长和清晰的边缘，典型的集落直径在毫米范围内。向hiPSCs引入DOX导致集落变得不那么致密，边缘变得粗糙。撤除干细胞培养基（即更换为N2B27+培养基）进一步分散了集落中心的细胞，但同时产生了具有3D性质的圆形子结构特征（第2天，深色区域，由箭头指示）。需要指出的是，从较小或较大尺寸的集落启动神经元分化，都显示出类似的结构重组和可比较的分化结果。在重新铺板到Matrigel包被的孔上后，细胞以单细胞形式生长并开始形成细长的突起。在接下来的几天里，细胞的形态逐渐转变为典型的神经元形态，并逐渐形成了清晰的神经元网络。使用Geltrex或Cultrex作为支持性细胞外基质（ECM），以不同细胞密度铺板，或在hiPSCs解冻后立即启动分化，都形成了类似的网络。
使用神经元免疫细胞化学（immunocytochemistry, ICC）染色来评估神经元分化效率。同时，测试了多种典型的ECM（即Matrigel、Geltrex、Cultrex、Vitronectin XF和聚-L-鸟氨酸（poly-l-ornithine, PLO）/层粘连蛋白），以探究分化方案对不同包被条件的稳健性。用Hoechst 33342对细胞核进行复染，并使用神经元标志物MAP2和NeuN来鉴定神经发生。在Matrigel、Geltrex和Cultrex上形成了清晰的神经元网络，并且细胞对NeuN呈阳性。MAP2和NeuN阳性细胞的比例分别约为85%和75%，不同ECM之间无统计学显著差异。值得注意的是，发现Vitronectin XF和PLO/层粘连蛋白与分化方法不兼容。对于这些ECM，细胞在第3天和第7天分别表现出形态异常，并且在更换培养基时细胞发生脱落，无法进行进一步分析。
使用多能性标志物NANOG和OCT4测试了分化程序早期（0–2 DIV，CID阶段）多能性的下调。hiPSCs初始的多能性通过NANOG和OCT4的稳定表达来显示，而在启动分化两天后信号消失。对归一化荧光强度和标志物阳性细胞比例（NANOG， OCT4）的定量分析表明，hiPSCs在神经元分化的早期就失去了多能性。具体而言，平均NANOG强度在第1天降低了75%，而OCT4强度降低了50%。在第2天，染色显示两种标志物的亮度均丧失了90%以上。就标志物阳性细胞比例而言，在第0天，接近100%的细胞是标志物阳性。在第1天，几乎所有细胞都是NANOG阴性，而约25%的细胞仍然是OCT4阳性。在第2天，两种多能性标志物阳性细胞比例均趋于0%。
使用神经前体细胞标志物巢蛋白（nestin， NES）进一步测试了CID阶段期间神经元转变和集落的结构重组。NES表达在第1天相比第0天有所增加，表明快速神经元分化。通过在不同焦平面（即底部（孔板表面）、顶部（集落最大高度）和相应的中间部分）对NES进行成像，可视化了第2天（即解离成单细胞之前）集落内部的结构重组。圆形子结构的平均高度为37.8 ± 7.6 μm。在底部、中部和顶部记录的NES图像显示，集落在表面保持其扩展状态，但集落上存在圆形的隆起。
在5、6和7 DIV时测试了分化细胞的电生理特性。神经元在第5天变得具有功能，在电流注入期间能够发放正常的动作电位串，以5、6和7天的神经元为例进行了展示。测得的细胞的电生理学特征被分为“动作电位串”（黄色）、“单次动作电位”（灰色）、“出现中动作电位”（橙色）和“无动作电位”（蓝色）四类。在第5天，大多数细胞（约83%）表现出明确的神经元命运迹象，即受到刺激时释放单次（70%）或多次（13%）动作电位。值得注意的是，另外16%的细胞显示出出现中的动作电位，这表明在第5天几乎所有被测细胞（约99%）都正在向神经元命运发展。让细胞再成熟两天，释放多次动作电位的细胞比例分别增加到22%（第6天）和48%（第7天）。此外，仅显示出现中动作电位的细胞比例在第7天降至仅6%。在所有条件下（5、6和7 DIV），随去极化电流增加，放电频率（定义为每个刺激周期（600 ms）内的动作电位数量）持续增加，在约20 pA去极化电流时平均达到每600 ms 4次动作电位。更大的去极化电流（高达40 pA）维持了平台化的动作电位数量。接下来，测试了细胞的早期内向电流和晚期外向电流。在施加电压阶跃期间，细胞显示出特征性的早期内向电流（负电流峰）和晚期外向电流（恒定的正电流）。根据施加的电压，对归一化至膜电容（MC，膜表面的度量）的峰值电流值进行量化，结果显示内向电流的幅度在5到7 DIV之间从约-60增加到-90 pA/pF。最后，确定了基本的电生理特性，如静息膜电位（RMP）、膜电容（MC）、膜时间常数（MTC）、膜电阻（MR）和动作电位动力学（高度、持续时间、后超极化（afterhyperpolarization, AHP）和阈值）。具体来说，RMP约为-50 mV，MC约为10 pF，MR约为5 GΩ，MTC约为130 ms。在动作电位动力学方面，平均动作电位高度约为58 mV，动作电位持续时间从第5天的4.5 ms缩短到第7天的3 ms，AHP约为20 mV，动作电位阈值约为-20 mV。值得注意的是，虽然在某些参数上观察到5、6和7天神经元之间略有趋势，但只有动作电位持续时间显示出统计学上的显著变化。
3 讨论
本文介绍的生成功能性神经元的方法以其极简化、快速以及与标准工作日程的良好兼容性而突出。使用高效预编辑的hiPSC细胞系消除了通常需要的修饰步骤（这些步骤大多使用病毒载体进行），从而也减少了安全规定的义务。省略转导步骤（其效率从未达到完美）也消除了任何纯化步骤（例如使用嘌呤霉素筛选）的需要。此外，不需要通常用于抑制不需要的细胞类型（如胶质细胞）增殖的细胞毒性补充剂阿糖胞苷（Ara-C），从而进一步降低了处理危险药物时违反规定的风险。从hiPSC集落而非单细胞启动神经元诱导的方法，避免了通常用于维持以单细胞形式培养的hiPSC所需的ROCK抑制剂（如Y-27632）的应用。最后，通过NGN2过表达引导神经元分化，可以从分化培养基中省略昂贵的神经元生长因子，如GDNF或BDNF，从而解决了通常与复杂的神经元分化相关的成本问题。值得注意的是，为期一周的分化方法相比于基于生长因子、小分子、拟胚体形成或双重SMAD抑制的传统方法要快得多，后者可能需要数周到数月的时间。最后，该方法可整合到标准工作日程中（即周末无需操作任务），这对研究人员来说具有吸引力，值得追求。
通过引入一种中间状态——集落-神经元状态，从集落（CID策略）而非从单细胞启动神经元分化，实现了从hiPSC到神经元的转化。在此背景下，有观点认为必须将hiPSC集落解离成单细胞，以为分化中的神经元开始产生神经突延伸提供足够的空间。事实上，描述本文所用hiPSC细胞系的原始文章也测试了从单细胞开始的神经元分化。然而，除了“空间自由论”之外，我们认为单细胞方法也是将现有的NGN2方案（这些方案从解离的hiPSC集落开始）应用于这些预编辑的NGN2 hiPSC的结果。通常，未修饰的hiPSC需要首先配备NGN2表达盒，然后才能启动NGN2介导的神经元分化。然而，使用病毒载体转导或电穿孔转染需要单细胞，以实现NGN2构建体的高效和均匀递送。因此，这些传统的NGN2方案从未从集落启动神经元分化，而只能从解离的单细胞开始。然而，如本文所述，从紧密的集落开始分化可能支持分化，因为密集培养（如拟胚体形成）可以促进神经发生。在DOX应用后，我们观察到多能性标志物在短短两天内迅速下调，这比文献报道的要快。集落的体积重组类似于神经玫瑰花结形成，这是在生成hiPSC来源的神经前体细胞过程中经常发生的过程。细胞集落的致密性也可能通过接触抑制支持细胞周期退出（这是神经发生所必需的），从而促进神经元分化。
分化结果显示，启动分化七天后，MAP2和NeuN阳性细胞比例很高（>75%），证实神经元表达了成熟的神经元标志物。MAP2和NeuN阳性细胞的比例与文献中的值相当或更高。分化效率在Matrigel、Geltrex和Cultrex上是相似的，这与其他使用Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤来源的ECM进行神经元分化的工作一致（尚无具体文献比较Cultrex）。对于失败的ECM（Vitronectin XF和PLO/层粘连蛋白），评估如下：Vitronectin XF是一种成熟的用于维持hiPSC的ECM。然而，据我们所知，该ECM尚未被描述用于神经元分化，这与我们的观察结果一致。至于PLO/层粘连蛋白，这种包被复合物应用广泛，并已被用于支持细胞粘附和神经元分化，但我们的分化方法未能证实这一点。
电生理学分析显示，神经元诱导后仅5天就出现了能发放多次动作电位的功能性神经元，据我们所知，这比任何其他使用hiPSC的NGN2介导的神经元分化程序都要快一倍。值得注意的是，这些方案除了NGN2外，还涉及其他转录因子或生长因子。到第7天，我们观察到约一半的测量细胞显示出动作电位串——与其他工作（67%）的比例相似，但后者是在更长的14天培养后获得的。随着注入电流的增加，神经元以增加的动作电位数量做出反应，并在约20 pA时达到平台期，这也已在其他文献中被描述。内向-外向电流显示出与其他hiPSC来源神经元类似的电压-电流关系。静息膜电位（约-50 mV）、动作电位高度（约50 mV）、动作电位持续时间（3–4.5 ms）和后超极化（约20 mV）均与文献报道一致。
hiPSC来源的神经元在跨学科领域的应用是多样的，例如生物医学工程、神经接口、血脑屏障建模或3D支架。从材料科学的角度来看，简单而有效的细胞模型是概念验证研究的关键组成部分。然而，当需要人类神经元来突出专业干细胞实验室之外的新应用时，hiPSC神经元分化方法的复杂性和冗长性阻碍了其在材料研究环境中的快速有效实施。尽管如此，仍可找到许多研究人员致力于进行广泛的hiPSC分化的例子，例如将纳米结构电极与hiPSC来源的神经元（69天）进行接口，在3D打印的微支架（91天）中培养神经元，或将其应用于微流控设备（>39天）。这些巨大的努力突显了需要如本文所述的简单易用的方法来获取hiPSC来源的神经元。我们相信，我们的方法将广泛加速并简化跨学科领域的研究。
4 结论与展望
在这篇方法文章中，我们提出了一种直接的方法，将DOX诱导的NGN2过表达与我们的CID策略相结合，在短短五天内生成功能性hiPSC来源的神经元。该方案极简化、成本效益高且非常稳健，使其对干细胞专业知识或基础设施可能有限的跨学科研究环境特别具有吸引力。
这项工作的意义超出了神经科学领域，因为快速生产功能性神经元的能力为跨学科研究打开了大门，例如将神经元与生物工程支架整合、研究神经元-材料相互作用或设计基于神经元的生物传感器。例如，在材料科学中，易于培养的神经元的可用性可以促进生物相容性基材的有效测试或神经-电子接口的开发。在机器人学和计算生物学中，这些功能性神经元可以作为开发将活细胞与计算设备融合的混合系统的生物模型系统。总之，这种易于采用的方法不仅对神经生物学，而且对材料科学和生物工程等领域都代表了一项宝贵的进步，有望加速创新，并扩大hiPSC衍生技术在多样化研究领域的可及性。
5 实验部分
5.1 hiPSC的维持培养
提供了一个简明的摘要。作者请参考补充材料（B部分）以获取培养和分化程序的详细分步说明。
hiPSC细胞系（BIONi010-C-13）购自欧洲诱导多能干细胞库（EBiSC.org），含有一个DOX诱导的NGN2表达盒，以促进神经元分化。hiPSCs在Matrigel包被的6孔板上培养，使用ReLeSR每周传代一次（室温下孵育5–6分钟），传代比例在1:20至1:100之间，取决于细胞汇合度。培养基（mTeSR+）每2-3天更换一次。
5.2 神经元分化
从培养五天的人iPSC集落启动神经元分化（0 DIV），方法是在mTeSR+培养基中添加2 μg mL-1DOX。第二天（1 DIV），将培养基更换为添加了2 μg mL-1DOX的N2B27+培养基。第二天（2 DIV），使用Accutase解离预分化的集落，并将细胞以200 k cm-2的密度铺在ECM包被的孔板上用于免疫细胞化学，或以100 k cm-2的密度铺在ECM包被的玻璃盖玻片上用于电生理学，培养基为添加了2 μg mL-1DOX的N2B27+培养基。2-3天后（总计4-5 DIV），更换为新鲜的添加了2 μg mL-1DOX的N2B27+培养基。
5.3 ECM包被
Matrigel、Geltrex、Cultrex（均为低生长因子）用Knockout DMEM稀释，并将孔板（24孔板，每孔300 μL）在室温下包被过夜。Vitronectin XF用CellAdhere稀释缓冲液稀释，并根据制造商说明在非组织培养处理的培养器皿（24孔板，每孔250 μL）上室温包被1小时。PLO/层粘连蛋白包被分两步进行：首先，PLO包被过夜或在37°C下至少3小时，然后用去离子水冲洗三次并风干。然后，层粘连蛋白根据制造商说明在DPBS中包被，每孔300 μL，37°C下2小时。
5.4 免疫细胞化学（ICC）染色
移除培养基，用4%多聚甲醛室温固定细胞15分钟。用DPBS洗涤三次，并将孔板储存在4°C的DPBS中备用。样品用渗透/封闭液（含3% BSA、0.2% Triton-X100、0.1% Tween-20的DPBS）室温封闭45分钟。一抗（溶于含0.1% BSA的DPBS中）4°C孵育过夜。使用的一抗包括NANOG、OCT4、NES、MAP2和NeuN。用DPBS洗涤两次后，二抗（溶于含0.1% BSA的DPBS中）室温避光孵育1小时。使用的二抗是Alexa荧光标记的二抗。然后用含0.05% Tween-20的DPBS洗涤三次，每次5分钟。在第二次洗涤步骤中加入Hoechst 33342进行复染。使用Leica Stellaris 5共聚焦激光扫描显微镜进行成像。
5.5 膜片钳分析
样品用浴液（140 mM NaCl， 2.4 mM KCl， 1.3 mM MgCl2， 2.5 mM CaCl2， 10 mM HEPES， 10 mM D-葡萄糖， pH 7.4，室温）冲洗三次，并用相同溶液覆盖。膜片电极内充满电极内液（125 mM 葡萄糖酸钾， 10 mM NaCl， 1 mM EGTA， 4 mM 镁-ATP， 10 mM HEPES， 10 mM D-葡萄糖， pH 7.4）。使用安装了红星探头前置放大器的HEKA EPC 10 USB膜片钳放大器，在反射光配置的Nikon Eclipse FN1正置显微镜上进行记录。电极由玻璃毛细管制备。数据由Patch Master V2×80软件记录，包括一个设置为2.9 kHz的贝塞尔低通滤波器，并自动补偿电容和串联电阻。
在5（n=60）、6（n=61）和7 DIV（n=49）分析了六批次，总共分析了170个细胞。神经元电生理学分类基于对电流阶跃函数（从-5 pA到23 pA或-5 pA到40 pA，阶跃为2 pA或5 pA）的反应。膜电位设定为-60 mV，电流注入持续600 ms。四种类别为：“动作电位串”（动作电位数量≥3）、“单次动作电位”（2 ≥ 动作电位数量 ≥ 1）、“出现中动作电位”（非动作电位但有膜电位的急剧变化）和“无动作电位”（在电流注入期间未检测到明显的锋电位）。动作电位定义为膜电位的急剧变化，需符合三个条件。仅对“动作电位串”电生理类别的神经元进行后续分析。通过计算相应的动作电位次数来确定放电频率。电生理参数测量和确定如下：静息膜电位（RMP）、膜电容（MC）由软件直接测定、膜电阻（MR）和膜时间常数（MTC）根据欧姆定律和相关参数推导确定、动作电位参数（幅度、阈值、后超极化、宽度（即持续时间））分析动作电位串中第一个动作电位、内向和外向电流在电压钳模式下记录。
5.6 统计与数据分析
每个实验的数据至少来自三次独立的分化。对于图像分析，每次分化从孔的随机位置记录至少三张图像。该方法使用在不同实验室购买的两批不同的hiPSC进行了验证。使用CellProfiler软件分析原始灰度图像。使用OriginPro软件分析数据，并绘制为平均值±标准差（SD）。使用单因素方差分析（ANOVA）及事后Tukey检验检验显著性。
