18-Crown-6醚能够增加在大肠杆菌中合成的聚(3-羟基丁酸)的分子量

《Journal of Bioscience and Bioengineering》：18-Crown-6 ether increases molecular weight of poly(3-hydroxybutyrate) synthesized in Escherichia coli

本研究发现向重组大肠杆菌培养基中添加18-冠-6醚（18c6）可显著提升聚-3-羟基丁酸（P(3HB)）分子量达20倍，且效果因单体而异，可能通过间接机制调控，为生产高聚物PHAs提供新方法。

　　

田中清也（Seiya Tanaka）| 菊川宏（Hiroshi Kikukawa）| 中井宏嗣（Hirotsugu Nakai）| 八月重一（Shin-ichi Hachisuka）| 松本健一郎（Ken'ichiro Matsumoto）

北海道大学化学科学与工程学院，日本札幌市北区N13W8，邮编060-8628

聚羟基烷酸酯（PHA）的分子量是其物理性质（尤其是机械强度）的关键决定因素。根据经验可知，PHA的分子量会受到微生物宿主和PHA合成酶（PhaC）类型等因素的影响。然而，目前控制PHA分子量的方法较为有限。在本研究中，我们发现向重组大肠杆菌（Escherichia coli）的培养基中添加环状聚醚18-冠-6醚（18c6）可以增加聚(3-羟基丁酸酯）[P(3HB)]的分子量。表达工程改造后的I类PHA合成酶PhaC_AR以及来自Megasphaera elsdenii的丙酰辅酶A转移酶的细胞在添加3HB的条件下进行培养，从而生产P(3HB)。在18c6浓度依赖性的作用下，P(3HB)的分子量增加了多达20倍。虽然18c6的添加抑制了大肠杆菌的生长，但对PhaC的表达水平没有显著影响。此外，体外实验表明18c6不会影响PhaC的酶活性。因此，这些结果表明18c6的作用并非与其与PhaC的直接相互作用有关。18c6的添加还增加了聚(3-羟基丙酸酯)的分子量，但并未影响聚(3-羟基己酸酯)的分子量，这说明18c6的效果取决于用于聚合物合成的单体类型。因此，18c6的添加可能成为一种生产高分子量PHA的通用方法。

研究片段

细菌菌株和质粒

使用大肠杆菌JM109作为聚合物生产的宿主菌株。细胞通过先前构建的pBSP_RephaC_AR(opt)pctalkK（含有来自Megasphaera elsdenii的丙酰辅酶A转移酶基因）和来自Pseudomonas putida的中链长度羟基烷酸酯-CoA连接酶基因进行转化。“(opt)”表示phaC_AR基因的密码子使用已部分优化，以适应大肠杆菌中的表达（参见之前的研究（18）。

结果

研究了冠醚对聚合物合成的影响（表1）。选用了两种冠醚18c6和15-冠-5醚（15c5）来探讨环大小对PHA合成的影响。通过¹H NMR分析证实了所有条件下都存在P(3HB)的合成（图S1）。在5–20 mM的测试浓度范围内，18c6抑制了细胞生长并减少了P(3HB)的产量；而15c5仅对细胞生长和聚合物产量产生了轻微的影响。

讨论

在研究非质子性聚醚对PHA合成影响的过程中，我们发现18c6能够增加P(3HB)的分子量。这是首次发现培养基中的添加剂能够显著提高PHA的分子量。因此，我们试图阐明这一现象的潜在机制。

先前的研究表明，所得P(3HB)的分子量会随着PHA合成酶的表达水平而变化（13）。因此，这可能是其中一个可能的解释机制。

作者贡献声明

田中清也（Seiya Tanaka）：负责撰写初稿、方法设计和实验研究。菊川宏（Hiroshi Kikukawa）：负责审阅和编辑。中井宏嗣（Hirotsugu Nakai）：负责实验研究。八月重一（Shin-ichi Hachisuka）：负责撰写、审阅和编辑。松本健一郎（Ken'ichiro Matsumoto）：负责撰写、审阅和编辑、项目监督及资金申请，以及研究概念的制定。

致谢

感谢北海道大学前沿化学中心提供的NMR分析支持。本研究得到了JST-Mirai计划（项目编号：JPMJMI19EB）和JSPS KAKENHI（项目编号：20H04368，资助对象为K.M.）的资助。