Costus igneus叶片辅助绿色合成还原氧化石墨烯纳米片：一种兼具细胞毒性潜力与显著体外及计算机模型抗糖尿病效力的新型纳米材料

《International Journal of Biomaterials》：Bio-Assisted Synthesis of Reduced Graphene Oxide Nanosheets From Graphene Oxide: Promising and Efficient Cytotoxic and Antidiabetic Potency in In Vitro, Kinetic, and In Silico Models

本研究展示了一种利用植物Costus igneus叶片提取物（Aq-CI）作为还原剂，通过绿色化学方法将氧化石墨烯（GO）转化为还原氧化石墨烯纳米片（CIrGO）的创新合成路径。通过系统表征确认了CIrGO的成功合成与稳定性。研究核心在于评估CIrGO的生物医学潜力：其展现出对Chang肝细胞和人胶质母细胞瘤U87MG细胞的剂量依赖性细胞毒性（MTT法），并能显著促进细胞葡萄糖摄取，效果与阳性药二甲双胍（metformin）相当。进一步的体外酶抑制研究揭示了CIrGO对α-淀粉酶（α-amylase）和α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）的有效抑制，酶动力学分析表明其为非竞争性抑制模式。分子对接与动力学模拟筛选出柯罗索酸（corosolic acid）为关键活性成分。研究结论指出，这种源于C. igneus的CIrGO纳米片代表了一种能降低血糖、缓解II型糖尿病并发症的新型抗糖尿病剂，为基于天然产物的纳米材料在生物医学应用领域提供了新思路。

　　

引言：糖尿病治疗挑战与绿色纳米材料的机遇

II型糖尿病（T2DM）的全球发病率正迅速攀升，其核心病理特征是高血糖。管理高血糖的关键策略之一是抑制负责碳水化合物消化的酶，即α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶，以减缓葡萄糖吸收、降低餐后血糖。然而，现有药物如阿卡波糖（acarbose）常伴随胃肠道副作用，因此开发高效、低毒的新型抑制剂迫在眉睫。天然植物来源的药物因其疗效和安全性日益受到重视。与此同时，石墨烯（graphene）因其优异的物理化学性质（如巨大比表面积、高电子迁移率）在生物医学领域展现出巨大潜力。其衍生物氧化石墨烯（GO）和还原氧化石墨烯（rGO）的合成通常涉及有毒化学还原剂，限制了其生物应用。因此，开发环境友好的“绿色合成”方法至关重要。本研究的焦点植物Costus igneus（火焰闭鞘姜，俗称胰岛素植物）是闭鞘姜科植物，其叶片在印度民间传统中用于控制糖尿病。本研究旨在利用C. igneus叶片提取物作为还原剂，绿色合成还原氧化石墨烯纳米片（CIrGO），并系统评估其细胞毒性、抗糖尿病效力及相关机制。

材料与方法：从合成到多维度评价

研究首先从印度海得拉巴获取C. igneus叶片，制备其水提物（Aq-CI），并通过多种化学测试（如FeCl₃、Legal、Dragendorff‘s测试）鉴定其中所含的植物化学物质，包括单宁、糖苷、生物碱、黄酮类、皂苷、蛋白质和酚类化合物。采用改良的Hummers法合成氧化石墨烯（GO）。随后，将GO分散液与5%的C. igneus叶片提取物混合回流，利用提取物中的植物化学物质作为还原剂和稳定剂，成功将GO还原为黑色粉末状的CIrGO纳米片。

为确认合成产物的性质，研究采用了多种表征技术。紫外-可见光谱（UV-vis）分析显示，GO的特征吸收峰从231 nm红移至CIrGO的268 nm，表明电子共轭体系的恢复。傅里叶变换红外光谱（FTIR）显示，CIrGO谱图中代表GO含氧官能团（如O-H、C=O）的特征峰强度显著减弱，证实了还原过程的去氧作用。拉曼光谱（Raman）显示CIrGO的D带与G带强度比（I_D/I_G）为0.81，与GO的0.84相比略有下降。X射线衍射（XRD）分析表明，GO在11.18°的特征衍射峰在CIrGO中消失，并在27.02°出现了一个宽峰，对应石墨结构的（111）晶面，层间距从GO的0.76 nm减小到CIrGO的0.33 nm。动态光散射（DLS）和Zeta电位分析显示CIrGO的水合粒径约为79.82 nm，略小于GO的80.89 nm，其Zeta电位为-22.9 mV，表明胶体溶液具有良好的稳定性。扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）图像证实CIrGO呈现薄层状、边缘碎裂的纳米片结构。能量色散X射线光谱（EDAX）分析显示CIrGO的碳/氧（C/O）原子比（2.58）高于GO（1.76），进一步支持了含氧官能团的去除。

生物活性评估在人类Chang肝细胞和人胶质母细胞瘤U87MG细胞中进行。通过MTT法评估细胞毒性。葡萄糖摄取实验采用葡萄糖氧化酶/过氧化物酶法，评估CIrGO和Aq-CI提取物促进细胞利用葡萄糖的能力。体外酶抑制实验分别评估样品对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性，并计算半数抑制浓度（IC₅₀）。酶动力学研究通过米氏方程（Michaelis-Menten）和双倒数图（Lineweaver-Burk plot）分析抑制类型。此外，研究还进行了计算机模拟分析：通过文献检索确定C. igneus叶片中已知的六种生物活性化合物（槲皮素、油酸、薯蓣皂苷元、柯罗索酸、儿茶素、β-谷甾醇），使用分子对接技术评估它们与α-淀粉酶（PDB: 1DHK）和α-葡萄糖苷酶（PDB: 4J5T）的结合亲和力，并基于对接评分、结合相互作用和低均方根偏差（RMSD）筛选出柯罗索酸进行后续的100纳秒分子动力学（MD）模拟，以验证复合物稳定性。所有生物实验数据均以均值±标准误表示，并使用GraphPad Prism进行统计分析，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）和Tukey事后检验评估显著性。

结果与讨论

1. CIrGO的绿色合成与表征

利用C. igneus叶片提取物成功实现了GO到CIrGO的绿色还原。颜色从GO的棕黄色变为CIrGO的黑色是还原成功的直观标志。推测的还原机制涉及提取物中丰富的多酚等植物化学物质。在碱性条件下，多酚解离出的阴离子作为亲核试剂，攻击GO表面的环氧基和羟基，经过中间体形成并脱去水分子，最终恢复石墨烯的共轭结构，同时植物化学物质也起到稳定纳米片、防止团聚的作用。

2. 细胞毒性评估

MTT实验表明，CIrGO对Chang肝细胞和U87MG细胞均表现出剂量依赖性的细胞毒性。对于Chang肝细胞，CIrGO的IC₅₀为235.72 μg·mL^?1，而Aq-CI提取物和阳性对照二甲双胍的IC₅₀分别为303.89 μg·mL^?1和327.01 μg·mL^?1。对于U87MG细胞，CIrGO表现出更强的细胞毒性，IC₅₀为199.73 μg·mL^?1，低于Aq-CI提取物（276.34 μg·mL^?1）和二甲双胍（346.74 μg·mL^?1）。结果表明，在较高浓度下，CIrGO可能通过诱导活性氧（ROS）生成导致细胞成分损伤和死亡，显示出潜在的抗癌活性。

3. 葡萄糖摄取促进效应

葡萄糖摄取实验显示，CIrGO能显著促进Chang肝细胞和U87MG细胞的葡萄糖摄取，且效果呈剂量依赖性。在Chang肝细胞中，当CIrGO浓度从12.5增至200 μg·mL^?1时，葡萄糖摄取率从13.01%提升至81.39%。在50 μg·mL^?1浓度下，CIrGO的葡萄糖摄取能力（34.42%）与二甲双胍（38.56%）相当。在U87MG细胞中也观察到类似趋势。这种促进作用可能源于CIrGO介导的葡萄糖转运体（GLUTs）调控、增强的葡萄糖代谢或改善的扩散过程。附着在CIrGO表面的多酚等植物化学物质可能通过模拟胰岛素作用或增强胰岛素敏感性来促进葡萄糖摄取。

4. 淀粉消化酶抑制活性及动力学

CIrGO对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均表现出显著的浓度依赖性抑制。对于α-淀粉酶，CIrGO的IC₅₀为84.46 μg·mL^?1，虽略高于阳性药阿卡波糖（65.46 μg·mL^?1），但显示出强效抑制。对于α-葡萄糖苷酶，CIrGO在200 μg·mL^?1时抑制率高达89.55%，IC₅₀为93.83 μg·mL^?1。酶动力学分析揭示，CIrGO对这两种酶的抑制均为非竞争性抑制。Lineweaver-Burk图显示，在抑制剂存在下，最大反应速率（V_max）降低，而米氏常数（K_m）基本保持不变。这表明CIrGO并非结合在酶的活性中心，而是结合在酶的其他位点，改变酶构象，从而降低其催化效率。这种抑制模式可能源于CIrGO纳米片与酶蛋白的氨基或羧基末端结合，改变了酶的天然构象。

5. 计算机模拟分析

分子对接研究比较了六种C. igneus叶片化合物与两种靶酶的结合能力。对接结果显示，柯罗索酸（corosolic acid）对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均表现出最佳的对接评分、有利的结合相互作用和较低的RMSD值。因此，选择柯罗索酸进行进一步的分子动力学模拟。100纳秒的MD模拟证实，柯罗索酸与两种酶形成的复合物在整个模拟过程中保持稳定，均方根波动（RMSF）较小，结合自由能计算也支持其稳定的结合。这从理论上支持了C. igneus提取物及CIrGO抗糖尿病活性的物质基础。

结论

本研究成功开发了一种利用药用植物Costus igneus叶片提取物绿色合成还原氧化石墨烯纳米片（CIrGO）的可持续方法。全面的表征技术证实了CIrGO的成功制备及其纳米片形态。生物学评估揭示了CIrGO具有双重生物活性：一方面，它对Chang肝细胞和U87MG癌细胞表现出剂量依赖性的细胞毒性，显示出潜在的治疗应用价值；另一方面，更重要的是，它能有效促进细胞葡萄糖摄取，并对调控餐后血糖的关键酶——α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶产生有效的非竞争性抑制，其效果与临床常用药物二甲双胍和阿卡波糖相当。计算模拟研究进一步将这种抗糖尿病活性与叶片中的特定成分柯罗索酸联系起来。综上所述，由C. igneus叶片衍生的CIrGO纳米片代表了一类新型的抗糖尿病候选剂，它通过多靶点作用（促进葡萄糖利用、抑制碳水化合物消化酶）来降低血糖水平，有望用于缓解II型糖尿病及其并发症。这项研究不仅为糖尿病治疗提供了基于天然产物和纳米技术的新思路，也展示了绿色合成纳米材料在生物医学领域的巨大应用前景。