《Journal of Chromatography B》：Phosphoproteomics elucidates the functional impact of the
PTPN11 p.Asn308Ser variant in a Noonan syndrome pedigree
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Noonan综合征（NS）致病基因PTPN11的Asn308Ser突变通过改变SHP2蛋白构象和互作网络，导致RAS/MAPK通路持续激活，并通过磷酸化核染色质重塑复合体（如SWI/SNF）实现胞质信号向核内表观遗传调控的传导，揭示NS从分子异常到发育缺陷的多层级致病机制。
徐伟静|谢立军|陈文军|陈家斌|邹静|徐子彦|王若丽|王晓兰|贾伟|张建辉|陈倩|余宏平|阮丹丹|高梅珠|张莉|朱耀斌|黄芳萌|廖立生|罗杰伟|林新福
福建省医科大学胜利临床医学院中医儿科系，福建省人民医院，福州大学附属医院，福州，中国
摘要
Noonan综合征（NS）是一种常见的常染色体显性遗传疾病，具有显著的临床异质性。编码SHP2蛋白的PTPN11基因突变是NS最常见的遗传原因。通过对一个具有典型面部畸形和矮小症状的家族进行基因测序，发现所有7名受影响个体都携带相同的杂合PTPN11变异（NM_001330437.2：c.923 A > G，p.Asn308Ser），该变异与临床表现共分离。通过结合实验结构分析、分子动力学模拟、蛋白质-蛋白质相互作用网络分析、定量磷酸蛋白质组学以及在细胞模型中的功能验证的多层次研究方法，我们系统地阐明了p.Asn308Ser突变的致病机制。研究表明，该突变破坏了关键的氢键并重塑了蛋白质相互作用网络，导致蛋白质构象异质性增加，并使蛋白质转变为激活的“开放”状态。因此，该突变增强了与GRB2和SRC等核心蛋白的相互作用，从而持续激活RAS/MAPK信号通路。磷酸蛋白质组学分析显示，该突变引发了广泛的磷酸化事件，其中差异性磷酸化的蛋白质在细胞核中富集，尤其是在与染色质组织和ATP依赖性染色质重塑相关的通路中。进一步的功能验证表明，异常激活的ERK可能磷酸化SWI/SNF等染色质重塑复合体，从而将细胞质信号传导直接与细胞核中的异常表观遗传调控联系起来。本研究揭示了PTPN11 p.Asn308Ser突变的完整致病机制，涵盖了原子构象变化到持续信号激活以及异常核染色质重塑的全过程。这些发现将NS的病理生理学理解扩展到了表观遗传学层面，并为针对信号通路和染色质状态的未来干预措施提供了理论基础。
引言
Noonan综合征（NS）是一种常染色体显性遗传疾病，其特征包括独特的面部特征（如眼距过宽、上睑下垂、内眦赘皮、耳垂位置低、鼻梁高拱）、轻度智力障碍、颈部短小、身材矮小、心血管异常、泌尿生殖系统畸形和血液系统异常[1] [2] [3] [4]。随着高通量测序技术的进步，已有超过10个基因的突变与NS相关联。这些基因中的大多数编码RAS/MAPK信号通路的关键成分，因此NS被归类为“RAS通路疾病”之一[5]。其中，PTPN11基因突变是NS最常见的原因，约占所有病例的50%[1]。
PTPN11基因编码非受体蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2，它在多种生长因子、细胞因子和激素的信号转导中起核心作用[6]。SHP2的正常功能依赖于其自身抑制的闭合构象与其活性开放构象之间的动态平衡[7]。在基础条件下，N-SH2结构域插入PTP结构域的催化中心，从而抑制其活性。当接收到上游信号（如与磷酸化酪氨酸残基结合）时，N-SH2结构域发生构象变化，解除对PTP结构域的抑制，激活SHP2的磷酸酶活性。这种激活又进一步激活下游信号通路，包括RAS/MAPK通路，精确控制细胞生长、分化和存活[8] [9]。大多数与NS相关的PTPN11突变是功能获得性突变，它们破坏了SHP2的自身抑制构象，导致其独立于上游信号而持续激活。这会导致RAS/MAPK信号通路的过度激活[10]，最终干扰胚胎发育并导致NS复杂的表型特征。
NS病理生理学的核心特征是其基因型与表型之间的相关性。特定突变会对SHP2蛋白产生不同的生化影响，调节其底物特异性、基础活性和SH2结构域的亲和力，从而产生临床异质性[11]。例如，N-SH2结构域中的D61G和E76K突变会减弱其与PTP结构域的相互作用，使SHP2的自身抑制构象打开[11] [12]；相反，D106A和E139D等突变则会导致磷酸肽诱导的磷酸酶活性异常升高[13]。本研究关注的Asn308残基位于PTP结构域内，先前的研究表明其致病性源于底物特异性的改变[13]。然而，目前仍缺乏直接的结构生物学证据来阐明这一特定突变如何在原子水平上改变蛋白质构象并破坏其自身抑制状态。以往的研究主要集中在RAS/MAPK等核心信号通路的激活上，但对于功能获得性突变引起的下游磷酸信号网络的全面系统变化了解仍然不足。阐明这些变化如何最终精确影响心脏和骨骼等组织的发育对于理解NS的表型异质性至关重要。
此外，目前对SHP2功能获得性突变的下游效应的理解主要局限于经典通路（如RAS/MAPK通路）的过度激活。一个关键且未解决的问题是，特定突变如何引起细胞磷酸信号网络的全球性、系统性改变。蛋白质磷酸化是一种由蛋白激酶和磷酸酶网络介导的关键可逆翻译后修饰，几乎调节所有生物过程，包括细胞增殖、发育、分化、神经活动、肌肉收缩和肿瘤发生[14] [15]，并与许多人类疾病相关[16]。RAS通路是一个高度保守的级联反应，涉及蛋白质-蛋白质相互作用和磷酸化，在控制细胞增殖、分化和存活的信号网络中起核心作用[16]。证据表明，NS相关的SHP2突变会增强特定底物（如SIRPα和PZR）的酪氨酸磷酸化，从而促进ERK的激活[17]。除了经典的RAS/MAPK通路外，SHP2还与PIK3R1等蛋白相互作用。激活的SHP2可以直接去磷酸化PI3K的抑制蛋白，并通过GAB等接头蛋白间接促进PI3K的激活[18]。这种平衡的破坏会影响AKT的磷酸化依赖性激活，最终导致疾病发生。然而，这仅反映了NS中潜在磷酸信号网络的一小部分。目前仍缺乏对特定NS相关突变下游磷酸蛋白质组的全面和无偏见的映射，这阻碍了我们理解异常信号如何特异性影响心脏和骨骼等组织发育的能力。
或许最重要的是，过度激活的细胞质信号与细胞核中发生的转录重编程之间的联系尚不清楚。持续激活的细胞质信号（如ERK）如何将异常信息传递到细胞核并重塑发育基因表达程序仍是一个未解决的深刻问题。特别是，异常信号与核心表观遗传机制（如ATP依赖性染色质重塑复合体）之间的直接功能联系是NS研究的前沿领域。确定突变SHP2信号是否以及如何影响染色质调节器可能为理解NS中基因表达的持续改变提供一个统一的机制。
为了解决这些知识空白，本研究利用了一个携带PTPN11 p.Asn308Ser突变的华人NS家族作为研究对象。通过整合计算结构生物学、相互作用组学、磷酸蛋白质组学和细胞功能验证（图1），我们旨在阐明Asn308Ser突变引起的原子级构象扰动及其对染色质调控的影响，并绘制其诱导的全球磷酸信号网络重联图谱。通过系统地研究从蛋白质构象功能障碍到信号通路异常，最终到染色质失调的致病级联反应，我们希望建立一个NS病理生理学的新型多层次模型。这种方法可能为未来的精确分子分型和靶向治疗策略提供新的见解。
研究对象
研究对象是一名6岁10个月的男孩，身高为104厘米（处于第3百分位数）。他的主要临床表现是身材矮小和独特的面部畸形，但运动和智力发育正常。心脏彩色多普勒超声检查显示肺动脉瓣狭窄、肺动脉扩张以及轻微的房间隔分流（提示卵圆孔未闭）。入院后进行了心电图、全脊柱X光和甲状腺功能检查。
家族表型
在17名家庭成员中，有7人被诊断为Noonan综合征。患者（III3）是一名6岁10个月的男孩，身高为104厘米（处于第3百分位数），因持续四年的身材矮小前来就诊。他的临床表现包括独特的面部特征（图2a），如倒三角形脸、眼距过宽、眼裂下倾、耳垂位置低、鼻根宽、鼻尖饱满和鼻梁凹陷。
讨论
通过整合临床遗传学、磷酸蛋白质组学、生物信息学和细胞实验，本研究阐明了在中国一个大型Noonan综合征家族中发现的PTPN11 c.923 A > G (p.Asn308Ser)突变的分子机制。基因共分离证实了该变异的致病性，该家族表现出典型的NS症状，包括肺动脉瓣狭窄和骨骼畸形。该突变位于蛋白质酪氨酸
结论
本研究表明，PTPN11的功能获得性突变通过增强与GRB2、SRC、PIK3CA、EGFR和PIK3R1等关键核心蛋白的相互作用，异常激活了RAS/MAPK/ERK信号通路。此外，我们发现激活的ERK向细胞核的转位会导致转录机制的功能失调，通过磷酸化染色质相关蛋白（如……）建立持续的转录激活状态。
CRediT作者贡献声明
徐伟静：撰写——原始草案、可视化、软件、方法学、数据分析。谢立军：资金获取、数据管理。陈文军：验证、软件、项目管理。陈家斌：软件、数据分析。邹静：撰写——原始草案、资源准备。徐子彦：资源准备、方法学。王若丽：资源准备、资金获取。王晓兰：验证、监督、资源准备。贾伟：项目管理、研究实施。张建辉：
伦理声明
本研究已获得中国福建省人民医院伦理委员会的审查和批准（批准编号：K2025–02-082）。所有参与者及其法定监护人已签署知情同意书。
资助
本研究得到了福建省科技创新联合基金（2024Y9081、2023Y9284、2024Y9130、2023Y9320、2023Y9126）、福建省自然科学基金项目（2025J08038、2024J011105、2024Y0033、2023J011846、2024J011017、2024J08250）、福建省卫生健康委员会科学技术计划（2024GGA090、2024QNA002、2024GGB02、2025QNGGA003）、福建省医科大学科研启动基金（2021QH1287、2022QH2042）的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究工作的财务利益或个人关系。
