pH响应性纳米颗粒修饰磷酸钙颗粒（SeMIA@TCP）：一种用于骨癌治疗的靶向给药与骨再生双功能平台

《Small》：pH-Responsive Nanoparticle-Coated Calcium Phosphate Granules for Bone Cancer Therapy

本研究提出了一种创新的pH响应性双功能骨支架材料。它通过亚胺键（imine bond）将硒掺杂介孔二氧化硅纳米颗粒（Se-doped MSNs）连接在β-磷酸三钙（β-TCP）颗粒上，实现了在骨肉瘤（OS）酸性微环境（pH 6.2–6.8）下触发纳米颗粒按需释放。该系统不仅对OS细胞（Saos-2, U2OS）表现出pH依赖的选择性细胞毒性，还能在纳米颗粒释放后促进人间充质干细胞（hMSC）的成骨分化（ALP活性和矿化），为骨肿瘤切除后的局部抗癌治疗与骨缺损再生提供了有前景的一体化解决方案。

　　

1 引言

骨肉瘤（Osteosarcoma, OS）是最常见的恶性骨肿瘤，其标准治疗方案包括手术切除联合辅助化疗/放疗，但治疗后生存率停滞不前，且切除后遗留的大面积骨缺损需要额外干预（如骨移植）。然而，现有的将抗癌药物直接负载于骨支架材料的双功能系统，普遍存在药物释放不可控、细胞内递送效率低等问题，可能导致局部药物过度累积并对周围健康组织产生细胞毒性。

纳米颗粒递送系统为克服这些挑战提供了可能。其中，介孔二氧化硅纳米颗粒（Mesoporous Silica Nanoparticles, MSNs）因其高负载能力、可调的孔结构和表面化学性质、纳米级尺寸及良好的生物相容性而备受关注。本研究团队先前开发了硒（Se）掺杂的MSN（SeM），其能响应谷胱甘肽（glutathione-responsive）释放硒离子，并通过增强细胞内活性氧（ROS）的产生而对OS细胞表现出显著的细胞毒性。

为了实现从骨支架材料上控制纳米颗粒释放，研究人员探索了多种刺激响应性连接子，如pH响应性（亚胺键、酯键）、酶响应性（MMP-9可切割肽序列）等。在骨肿瘤应用中，pH响应性连接子尤其具有吸引力，因为OS组织的细胞外微环境（pH 6.2–6.8）呈弱酸性，与健康骨骼的近中性pH形成鲜明对比。亚胺键在此弱酸性条件下可预测性地断裂，而在生理pH下保持稳定，从而能够在肿瘤环境中实现纳米颗粒的选择性释放。

基于此，本研究设计并开发了一种双功能系统：硒掺杂MSN修饰的β-磷酸三钙（β-TCP）颗粒（SeMIA@TCP）。在该结构中，硒掺杂MSN表面被修饰了亚胺键，并通过共价连接阿仑膦酸钠（Alendronate, ALN）来增强与TCP基底的结合力（利用ALN的膦酸根基团与TCP表面丰富的Ca²⁺离子的强亲和力）。β-TCP颗粒作为纳米颗粒载体和骨移植替代物，具有优异的生物活性、骨传导性和骨诱导性，其球形形态有利于填充不规则的骨缺损。该平台旨在利用pH响应性纳米颗粒释放和成骨特性，实现残余OS细胞的消除与骨再生的双重目标。

2 结果

2.1 ALN/亚胺功能化硒掺杂MSN的制备

通过多步法成功合成了ALN/亚胺功能化的硒掺杂MSN（SeMIA）。首先，通过一锅法合成硒掺杂MSN（SeM）。随后，通过席夫碱反应将甲酰苯氧乙酸连接子连接到SeM表面，形成亚胺功能化的SeM（SeMI）。最后，通过EDC/Sulfo-NHS反应将ALN共价连接到SeMI上，得到SeMIA。为了进行纳米颗粒示踪，本研究额外合成了未掺硒但标记了ATTO-647染料的ALN/亚胺功能化MSN（₆₄₇MIA），以及不含亚胺键的ALN功能化MSN对照（₆₄₇MA）。

透射电子显微镜（TEM）显示，与未修饰的SeM相比，SeMIA的表面较为模糊，介孔结构不如前者清晰，这可能是ALN连接改变了表面粗糙度和局部对比度所致。Zeta电位测量证实了亚胺键和ALN连接后纳米颗粒表面电荷的预期变化。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析显示，在1630 cm^-1处出现了N=C伸缩振动峰，证实了亚胺键的成功连接；在860–880 cm^-1（P–O伸缩振动）、1045 cm^-1（P–O不对称振动）和2950–2985 cm^-1（C–H伸缩振动）出现的特征峰证实了ALN的存在。此外，在pH 6.4缓冲液中孵育后，含有亚胺键的₆₄₇MIA表面电荷显著增加，而在pH 7.4下无此变化，证实了亚胺键的pH敏感性可裂解性。

2.2 纳米颗粒组装β-TCP颗粒的制备与表征

通过乳液法制备了直径约1 mm的球形β-TCP颗粒。X射线衍射（XRD）和FTIR分析证实了β-TCP是其主要晶相。随后，通过共浸泡法将纳米颗粒组装到β-TCP颗粒上。荧光定量分析表明，与未修饰的MSN（₆₄₇M@TCP）相比，ALN功能化的MSN（₆₄₇MA@TCP）和ALN/亚胺功能化的MSN（₆₄₇MIA@TCP）在TCP上的负载效率更高，其中₆₄₇MIA@TCP的负载效率最高。这证实了ALN通过其与TCP表面Ca²⁺的强亲和力，在增强纳米颗粒负载方面起到了关键作用。延长浸泡时间（至72小时）也进一步提高了负载效率。

2.3 pH响应性纳米颗粒释放

在模拟OS微环境（pH 6.4）、生理环境（pH 7.4）和强酸环境（pH 5.0）的缓冲液中评估了纳米颗粒的释放行为。₆₄₇MIA@TCP在所有酸性条件下均表现出最快速和最显著的纳米颗粒释放。在pH 6.4时，其释放量显著高于₆₄₇MA@TCP，这突出了亚胺键裂解对释放的额外贡献。₆₄₇MA@TCP在低pH下也有一定释放，表明ALN–Ca²⁺相互作用本身也具有pH敏感性。相比之下，₆₄₇M@TCP在所有pH条件下的释放效率最低。亮场显微镜观察证实，TCP颗粒本身在酸性条件下未发生显著尺寸变化，说明纳米颗粒的释放主要源于界面相互作用（亚胺键裂解和ALN–Ca²⁺结合减弱）而非载体降解。这些结果验证了SeMIA@TCP体系强大的pH响应性释放能力。

2.4 细胞毒性

在二维细胞共培养模型中评估了SeMIA@TCP对OS细胞（Saos-2和U2OS）和人骨髓间充质干细胞（hMSC）的细胞毒性。

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  对OS细胞的毒性：SeMIA@TCP在酸性条件（pH 6.4）下对两种OS细胞系的细胞毒性显著高于中性条件（pH 7.4），呈现出明显的pH响应性抗OS效应。这种细胞毒性是剂量依赖性的，高剂量（SeMIA@TCP₄）的毒性效应更持久。活/死染色结果与定量MTS检测结果一致。
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  对hMSC的毒性：在生理pH下，SeMIA@TCP对hMSC表现出很高的生物相容性（细胞存活率>80%）。在酸性pH下，即使暴露于SeMIA@TCP，hMSC的存活率也显著高于OS细胞，显示出对OS细胞的选择性毒性。然而，在高剂量（SeMIA@TCP₄）和长时间（5天）酸性暴露下，hMSC的活力也会受到影响，表明其毒性具有剂量和时间依赖性。
  综上所述，SeMIA@TCP能有效靶向酸性微环境中的OS细胞，同时在生理条件下对hMSC保持较高的生物相容性，体现了其肿瘤微环境响应性。

2.5 细胞摄取与ROS检测

使用₆₄₇MIA@TCP模型研究细胞对纳米颗粒的摄取。荧光显微镜和流式细胞术分析均表明，在酸性条件下（pH 6.4），Saos-2细胞和hMSC对纳米颗粒的摄取量均显著高于中性条件（pH 7.4）。两种细胞在酸性条件下的摄取效率没有显著差异，表明选择性细胞毒性并非源于摄取差异。

进一步检测细胞内活性氧（ROS）水平发现，在酸性条件下与SeMIA@TCP共培养后，Saos-2细胞和hMSC内的ROS水平均随时间增加而升高，其中Saos-2细胞的ROS上调更为显著。而在中性条件下，ROS水平则保持较低。这表明pH响应性纳米颗粒释放和细胞内化后，触发了细胞内ROS的生成，且OS细胞对此更为敏感，这可能与其固有的氧化还原稳态失衡有关。

2.6 成骨分化

为了模拟临床治疗中先抗癌后促再生的过程，研究建立了一个“纳米颗粒释放后TCP”模型。先将SeMIA@TCP与OS细胞在酸性培养基中孵育5天以释放纳米颗粒，然后将释放后的TCP颗粒（(SeMIA@)TCP）与hMSC在中性条件下共培养，评估其成骨潜能。

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  碱性磷酸酶（ALP）活性：在基础培养基中，(SeMIA@)TCP₄能随时间显著上调hMSC的ALP活性（培养21天和28天后分别提高3.2倍和2.5倍）。在成骨诱导培养基中，这种促进作用被进一步放大（21天和28天后分别提高6.3倍和8.3倍）。
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  矿化：茜素红S染色显示，(SeMIA@)TCP₄在基础培养基和成骨诱导培养基中均能诱导hMSC发生显著的矿化沉积，且在成骨诱导培养基中培养28天后效果最明显。
  这些结果证实，在纳米颗粒释放后，β-TCP载体本身保留了其固有的成骨生物活性，能够有效促进hMSC的成骨分化和矿化。

3 讨论

本研究开发的双功能材料，其核心设计理念是将局部、刺激响应性的纳米颗粒释放与临床相关骨替代材料（β-TCP颗粒）的内在生物活性相结合。与通常依赖细胞外药物释放的传统载药系统相比，本系统通过pH响应性连接策略，实现了在OS酸性微环境下纳米颗粒的选择性释放和细胞内递送，从而可能提高治疗效率并减少脱靶毒性。

纳米颗粒的pH响应性释放主要归因于亚胺键的酸致裂解，以及ALN–Ca²⁺相互作用的pH依赖性减弱。增强的细胞毒性与酸性条件下纳米颗粒释放增加、细胞摄取增多以及随之而来的ROS水平升高密切相关。OS细胞对SeM介导的ROS上调更敏感，这解释了其对OS细胞的选择性毒性。

从转化角度来看，肿瘤相关的酸中毒与肿瘤代谢活动密切相关，是一个动态且可逆的过程。当肿瘤细胞被有效抑制或清除后，局部微环境可能逐渐恢复到生理pH。因此，pH响应性纳米颗粒释放系统非常适合用于在酸性条件下进行局部肿瘤治疗，随后转向支持TCP载体介导的骨相关过程的中性环境。

研究证实，纳米颗粒释放后的TCP颗粒能有效促进hMSC的ALP活性和基质矿化，凸显了β-TCP作为再生组分的功能。本研究在二维细胞培养模型中建立了这些效应，更复杂的体外共培养或三维模型以及体内骨缺损或肿瘤模型将是未来全面评估其疗效和安全性的必要方向。

4 结论

本研究成功开发了一种pH响应性的纳米颗粒可释放β-TCP颗粒系统（SeMIA@TCP）。该系统结合了局部抗癌活性和临床相关骨替代材料的成骨生物活性。ALN连接显著增强了纳米颗粒在TCP上的负载，而亚胺键功能化则实现了纳米颗粒在酸性条件下的特异性释放。体外研究表明，SeMIA@TCP在酸性条件下对OS细胞具有显著的抑制作用，同时对hMSC的毒性较低，且在纳米颗粒释放后，TCP载体仍能有效促进成骨分化。该研究为设计用于局部OS治疗和后续骨修复的双功能平台提供了一个概念验证。

5 材料与方法（概述）

研究详细描述了硒掺杂MSN（SeM）的合成、亚胺键引入和ALN功能化（SeMIA）的步骤，以及β-TCP颗粒的乳液法制备、纳米颗粒通过共浸泡法组装到TCP上。表征手段包括TEM、DLS、FTIR、荧光标记、XRD、SEM等。纳米颗粒释放研究在三种pH的缓冲液中进行并通过荧光成像定量。细胞毒性通过MTS法和活/死染色评估。细胞摄取通过荧光显微镜和流式细胞术分析。ROS水平使用DCFH/DA探针通过流式细胞术检测。成骨分化通过ALP活性测定（使用CDP-star底物）和茜素红S矿化染色进行评估。所有数据均以平均值±标准差表示，并进行适当的统计学分析。