面向细胞无线电刺激的可悬浮、可扩展超声驱动氧化锌纳米片压电微型器件

《Small》：Suspendable and Scalable Ultrasound-Actuated ZnO-Nanosheet-Based Piezoelectric Microdevices for Wireless Electrical Stimulation of Cells

这篇综述介绍了一种基于压电氧化锌纳米片（ZnO NSs）的新型微型生物电子器件，它利用超声驱动实现单细胞级别的无线电刺激。研究证明了该器件的细胞兼容性，并揭示了其通过压电效应激活细胞膜电压门控钙通道（VGCCs）和牵张激活阳离子通道（SACCs）从而引起细胞内钙瞬变（Ca2+）的机制，为开发微创、高空间分辨率的细胞级生物电子接口（如骨再生、神经调控等）提供了创新方案。

　　

微器件制备与表征

研究团队利用硅微加工技术制备了尺寸约为3.4微米×3.4微米的二氧化硅（SiO₂）微颗粒平台。通过水热合成法，在微颗粒表面均匀生长了厚度约为21纳米的氧化锌纳米片（ZnO NSs），形成最终的压电微型器件。扫描电子显微镜（SEM）图像显示，微器件尺寸约为4.9微米，表面被随机取向的ZnO NSs均匀覆盖，其压电系数（d₃₃）为4–6皮米/伏特。器件可从硅片上剥离并悬浮于液体中，便于与细胞进行相互作用。

电学性能与超声驱动验证

为验证ZnO NSs的压电响应，研究构建了由ZnO NSs夹在铂（Pt）和钼（Mo）电极之间的测试器件。当使用频率为3兆赫兹（MHz）的超声进行驱动时，产生的峰值电压与超声强度成正比：在0.2、0.6、1.0和2.0瓦特/平方厘米（W cm^-2）的强度下，测得的峰峰值电压分别为0.8 ± 0.1、1.3 ± 0.1、1.6 ± 0.1和3.1 ± 0.3毫伏（mV）。这证实了超声能够有效地无线驱动ZnO NSs产生电信号。

细胞兼容性与安全性评估

将微器件以2:1（微器件:细胞）的比例与人骨肉瘤细胞（Saos-2细胞）共培养，评估其细胞毒性。结果表明，微器件在培养1、3、7天后均符合ISO 10993-5标准的细胞兼容性要求。此外，研究测试了超声驱动（3 MHz，强度0.2、0.6、1.0 W cm^-2）对细胞活力的影响。细胞在经历三轮10秒超声刺激（间隔5分钟）后，24小时的存活率仍高于90%，证明该驱动方法安全无害。扫描电镜观察也证实，超声刺激后微器件的结构和ZnO NSs的附着均保持完好。

压电刺激引发细胞内钙激活的机制

研究使用覆盖有ZnO NSs的玻片培养Saos-2细胞，以探究细胞与纳米结构相互作用时的钙信号机制。在没有外部超声驱动、仅依靠细胞自身对ZnO NSs施加作用力的情况下，通过钙成像技术发现，生长在ZnO NSs上的细胞中有51%出现了细胞内钙瞬变，而对照组玻璃片上的细胞仅有14%。

为厘清钙离子来源，研究进行了药理学阻断实验：

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  在无钙培养液中，ZnO NSs组出现钙瞬变的细胞比例降至13%，表明约75%的钙离子来源于细胞外流入。
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  使用电压门控钙通道（VGCCs）阻断剂硝苯地平（nifedipine）后，ZnO NSs组出现钙瞬变的细胞比例降至33%。
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  使用牵张激活阳离子通道（SACCs）阻断剂钆（gadolinium）后，该比例降至20%。

这些结果表明，细胞施加在ZnO NSs上的机械力诱导产生了局部电场，主要激活了细胞膜上的VGCCs和SACCs，导致细胞外钙离子内流。此外，使用膜电位敏感染料DiBAC₄(3)进行的成像实验证实，与ZnO NSs接触的细胞发生了明显的膜电位去极化事件，进一步验证了细胞与纳米发电机之间的直接电耦合。

超声驱动微器件对细胞的电刺激效果

为进一步实现可控刺激，研究将仍附着在硅片上的微器件阵列与Saos-2细胞共培养，并施加超声驱动。在3 MHz频率下，分别以0.2、0.6和1.0 W cm^-2的强度进行三轮刺激（每轮10秒，间隔5分钟），并通过钙成像监测细胞响应。

关键发现如下：

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  在最高强度1.0 W cm^-2下，与微器件接触的细胞，在经过三轮刺激后，累计有58%的细胞被激活（出现钙瞬变），而对照组细胞的激活率仅为29%。
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  在0.2 W cm^-2强度下，微器件组细胞的累计激活率为51%，也显著高于对照组的30%。
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  在0.6 W cm^-2强度下，对照组细胞也出现了较高的基础激活率（45%），研究者推测这可能源于超声本身对离子运输或SACCs的直接影响。然而，微器件组的激活率（50%）仍显示出由压电势带来的附加效应。

这些结果证明，超声驱动的压电微器件能够有效且无线地增强对单细胞的电刺激。

有限元建模（FEM）模拟验证

研究通过COMSOL软件进行了有限元建模，模拟单个ZnO NS在超声驱动下与细胞膜相互作用时产生的电场。模拟设定了两种情形：一是NS顶端自由，距细胞膜5纳米；二是NS顶端嵌入细胞膜内。

模拟结果显示：

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  当NS顶端自由时，在1.0 W cm^-2超声强度下，在细胞膜附近产生的电场强度约为10⁰–10²V cm^-1。
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  当NS顶端嵌入细胞膜时，产生的电场强度显著升高，达到10³–10⁴V cm^-1。

已知电场强度高于10 V cm^-1即可激活VGCCs。模拟结果表明，尤其是嵌入或紧密接触细胞膜的ZnO NS，完全有能力产生足以打开VGCCs的局部电场，从理论上支持了实验观察到的生物学现象。

结论与展望

本研究成功开发并验证了一种细胞兼容、亚细胞尺寸的无线压电微器件。该器件结合了硅微加工的可扩展性与ZnO纳米片的压电特性，能够通过超声无线驱动，实现对单细胞的高空间分辨率电刺激。机制研究表明，刺激主要通过激活细胞膜上的VGCCs和SACCs，引发细胞外钙内流和钙瞬变。有限元模拟为这一电生理过程提供了理论支撑。这项工作展示了压电材料在细胞水平生物电子接口中的巨大潜力，为未来在骨再生、神经调控、心脏起搏、肌肉刺激等微创生物医学应用领域的开发奠定了基础。