《Advanced Science》：The Age-Dependent Resident Myonuclear Multi-Omic Response to an Acute Skeletal Muscle Hypertrophic Stimulus in Mice
编辑推荐：
这篇综述利用多组学方法，深入探究了成年与衰老小鼠骨骼肌在急性机械超负荷刺激下，肌细胞核（myonuclei）在转录组和DNA甲基化层面的差异性分子反应。研究表明，年龄会影响肌细胞核的表观遗传可塑性及其对促肥大信号的反应能力，这为揭示年龄相关的肌肉适应性减退（如老年性肌肉减少症sarcopenia）的内在机制提供了重要分子图谱，并为寻找增强老年肌肉适应性的治疗靶点指明了方向。
1 引言
骨骼肌具有独特的合胞体结构，每条肌纤维含有数百至数千个细胞核（肌细胞核），这使得精准解析其适应性反应的分子机制充满挑战。随年龄增长，肌肉对抗阻训练的适应性（即肌肉可塑性）会下降。为了克服技术障碍，本研究利用了一种名为HSA-GFP的遗传修饰小鼠模型，通过多西环素诱导、荧光标记并分选纯化出常驻肌细胞核，结合组织RNA测序、肌细胞核DNA甲基化分析、多组学整合以及单肌细胞核RNA测序技术，旨在描绘成年与衰老小鼠骨骼肌在急性机械超负荷刺激早期，肌细胞核驱动的分子反应蓝图。
2 结果
2.1 年龄对静息状态小鼠骨骼肌转录组的影响
主成分分析显示，成年与衰老小鼠的骨骼肌转录组存在显著差异。衰老肌肉表现出更大的转录变异性。共鉴定出3200个差异表达的蛋白质编码基因。与衰老相关的上调通路主要涉及线粒体基因表达、翻译和核糖体结构基因，而下调通路则与细胞外基质组织相关。
2.2 成年与衰老小鼠对急性肥厚刺激的炎症与代谢转录谱保守性
在成年和衰老小鼠中，MOV均能诱导大量差异表达基因。通路富集分析显示，上调的GO通路均主要与免疫反应相关，这反映了MOV早期显著的炎症细胞浸润。而下调的通路则主要由线粒体组织、细胞呼吸和能量代谢相关的代谢过程主导，提示存在一种类似Warburg效应的代谢转换，即糖酵解和磷酸戊糖途径增强，线粒体呼吸减弱，以支持生物质积累。
2.3 miR-1对高尔基体相关和线粒体基因表达的年龄非依赖性调控
分析发现，无论在哪个年龄段，myomiR miR-1都是解释MOV诱导基因上调的最关键微小RNA（miRNA）。MOV导致两种年龄小鼠的肌肉中miR-1水平均急剧下降。为了验证其功能，研究人员使用了肌纤维特异性、他莫昔芬诱导的miR-1敲除小鼠模型。RNA测序显示，miR-1的缺失导致高尔基体膜和内质网膜相关基因上调，同时下调细胞呼吸和氧化还原酶活性相关基因。这些数据表明，miR-1可能是肌肉代谢转换和细胞内膜系统重塑的关键共同调节因子，其作用与年龄无关。
2.4 细胞解卷积分析揭示成年与衰老肌肉对MOV的细胞贡献差异指向神经肌肉接头
利用已发表的单细胞RNA测序数据集进行细胞解卷积分析，预测了MOV过程中不同细胞类型的贡献。结果显示，无论是成年还是衰老肌肉，肌细胞核都是转录的主要来源。然而，统计分析表明，在MOV期间，成年小鼠的神经胶质细胞和肌肉卫星细胞群的比例高于衰老小鼠。神经胶质细胞在神经肌肉接头完整性中发挥作用，而卫星细胞的激活和增殖在衰老肌肉中受损。这些发现提示，卫星细胞、神经胶质细胞和神经支配相关过程在衰老肌肉的MOV中可能受到损害，这可能部分解释了年龄依赖性的肌肉可塑性下降。
2.5 组织转录组水平上MOV反应的年龄相关基因表达差异
尽管成年和衰老小鼠对MOV的转录反应有显著重叠，但仍有相当数量的基因表达具有年龄特异性。例如，有23个基因在成年和衰老小鼠中呈现相反的表达模式。此外，与成年MOV相关的上调通路涉及核糖核蛋白复合物生物发生和突触前翻译，而下调通路则与蛋白酶体和内肽酶复合物相关。相比之下，衰老小鼠MOV特有的上调基因与凝血、止血和细胞运动负调控有关，表明衰老肌肉对MOV的早期反应可能更偏向于伤口修复过程。
2.6 肌细胞核DNA甲基化组受年龄显著影响，且衰老肌肉对MOV的反应性远低于成年
通过使用低输入量简化代表性亚硫酸氢盐测序技术，研究人员分析了常驻肌细胞核的DNA甲基化组。结果显示，衰老本身显著改变了肌细胞核的DNA甲基化状态。更重要的是，与成年MOV相比，衰老肌肉中的肌细胞核对MOV的DNA甲基化反应要小得多。衰老肌肉中差异甲基化位点的百分比变化较小，且存在差异甲基化的基因数量更多但更分散，这表明衰老肌肉对负荷的表观遗传反应可能更不协调，灵活性更低。
2.7 & 2.8 甲基组-转录组整合显示年龄对肌肉转录组的表观遗传调控，以及成年MOV中肌肉生长导向基因的表观遗传控制更强
通过使用BETA工具进行多组学整合分析，研究者发现，成年与衰老小鼠中，有相当一部分基因的表达可能受DNA甲基化调控。在共同受调控的基因中，成年MOV的基因平均拥有更多的预测调控性CpG位点，且这些位点离转录起始点的距离更近。例如，与肌肉质量调节相关的基因Myc、Runx1、Mybph和Ankrd1，在成年MOV中显示出更强的诱导表达，并伴有更显著或更靠近TSS的甲基化变化。相反，在衰老MOV中，胶原基因（如Col4a1, Col4a2）和白细胞介素受体（如Il1r1, Il1r2）等与细胞外基质和炎症/免疫过程相关的通路受到独特的表观遗传调控。这些差异可能解释了衰老肌肉在应对生长刺激时关键促肥大基因（如Myc）反应钝化，而纤维化和炎症反应增强的现象。
2.9 成年与衰老肌肉的单肌细胞核RNA测序揭示了神经支配和Nr4a3基因的年龄依赖性调控
单肌细胞核RNA测序鉴定出几个肌细胞核簇，包括一个Atf3阳性的细胞群，该群在MOV后比例从约2%扩张至约15%。在静息状态下，衰老肌细胞核中Erc2、Nr4a3和Runx1等基因表达上调。其中，Erc2和Nr4a3的上调与肌细胞核中靠近转录起始点的CpG位点低甲基化相关。Runx1的上调与肌肉去神经支配状态相关，提示衰老肌肉基线状态可能存在神经支配异常。
2.10 急性MOV揭示的年龄依赖性肌细胞核特异性基因表达
在单肌细胞核水平，成年和衰老小鼠对MOV的许多应答基因是共同的，如Atf3、Ankrd1、Igf2bp2和Creb5。然而，一些基因的表达存在年龄差异。特别是在扩张的Atf3阳性细胞群中，Ankrd1、Atf3、Cd44等基因在成年MOV中的诱导程度高于衰老。此外，成年肌肉的Atf3阳性肌细胞核更强地诱导了与神经肌肉重塑相关的基因（如Ampd3、Ankrd1、Kcnn3、Ncam1、Runx1），并且这些变化与肌细胞核DNA甲基化状态相关。这些数据共同提示，成年肌肉在应对负荷时，其肌细胞核驱动的神经肌肉连接重塑信号更强。
3 讨论与展望
本研究通过多组学整合分析，首次详细描绘了常驻肌细胞核对急性肥大刺激的年龄依赖性分子反应图谱。研究证实，衰老肌肉在静息状态下已发生广泛的转录组和甲基化组改变，这可能预置了其对生长刺激的迟钝反应。MOV诱导的许多核心转录变化（如代谢转换）在成年和衰老肌肉中是保守的，并受miR-1调控。然而，关键的区别在于：1）衰老肌细胞核的表观遗传可塑性（特别是DNA甲基化反应的幅度和协调性）显著降低；2）成年肌肉能更强地诱导与核糖体生物发生、DNA复制（如Mcm基因）和肌肉发育相关的基因；3）衰老肌肉则表现出更强的炎症和纤维化相关基因表达；4）单核分析进一步揭示了成年肌肉在MOV早期具有更强的神经肌肉连接相关基因的肌细胞核特异性诱导。这些发现将肌细胞核的表观遗传和转录状态与年龄相关的肌肉适应性下降联系起来，为未来开发针对老年肌肉衰减症、增强肌肉可塑性的干预策略提供了潜在的分子靶点。研究的局限性包括仅使用了雄性小鼠，且仅分析了MOV早期的反应。未来的研究需要验证这些发现在雌性小鼠以及更长期负荷模型中的普适性。
